Способ иммобилизации микробных клеток

ОП ИСАНИЕ Союз Советских Социалистицеских Республик(32) 27.03.74 риорит Государственный комитет Совета )еннистрав СССР оо делам изобретений и открытий(43) Опубликовано 250578, Бюллетень 19 5) Дата оп икования описания 26047 Иностранец Роджер Питер нельсон(72) Автор изобретения ностранная Фирм Пфайзер инки(7 Ц Заявитель ОБ ИММОБИЛИЗАЦИИ МИКРОБ 54) ТО менекойВ еток та- со- ениИэобретенне относится к способу получения препаратов микробных клеток, иммобилизованных на нерастворимой подложке, которые и в связанном виде об- ладают присущей им. в нативном состоянии способностью каталиэнровать неко торые химические превращения благодаря наличию внутриклеточных Ферментов. Предлагаемые препараты могут найти приние в химической, Фармацевтичеси пищевой промышленности.литературе описаны способы получения препаратов иммобилизованных на носителях микробных клетокВ частности, описан способ получе ния адсорбированных на кожном коллаге. не клеток штамма СгерСопчсее рЪаЕосЬюеоцедем содержащих активную глюкозоиэомеразу и способ удержания в геле грибковых клеток, содержащих 3) гидроксилирующнй фермент, способный катализировать превращение, конечным продуктом которого является кортиэол.Однако, в литературе отсутствуют сведения о способе получения иммоби лиэованных микробных клеток, предотвращающем диссоциацию (вымывание) кл из носителя при манипулировании с кими препаратами в реакторах. Дис циация клеток сопровождается сниж 30 ем активности реактора и загрязнением реакционного потока. Для предотвра.щения такой диссоциации или сведения ее к минимуму приходится жестко ограничивать условия проведения реакций.Предлагается способ получения ста.бильных препаратов иммобилизованных микробных клеток, в которых не происходит вымывание клеток иэ носителя в процессе реакции, заключающийся в том, что иммобилиэация микробных клеток про исходит посредствам создания ковалентных связей между клетками и водонерастворимой полимерной матрицей.В предлагаемом способе нативные микробные клетки ковалентно связываются с водонерастворимыми макрочастицами полимера, несущими реакционноспособные группы, На наружной поверхности клеточных мембран находится большое количество;Функциональных групп - (таких как амтеногруппы, гидроксильные и сульфгидрильные.группы н др.), способных,реагировать с реакционноспособиыми группами, содержащимися в полймере (например, эпоксидных, галоидкарбонильных или галоидметнлкарбонильных)Образование ковалентных связей может происходить либо перед, либо после образования полимера. В первом слу20 25 чае микробные клетки контактируют сэтиленненасыщенным мономером, содержащим реакционноспособные группы, а а:;.-.тем мономер подверга 1 от полимеризацииили сополимеризации в присутствеи мо"номера, образующего поперечные связи,и инйциирующей системы. Во втором случав, микробные клетки подвергают ие=посредственному взаимодействию с макрочастицами полимера, содержащегореакционноспособные группы. Такимиполимераьи могут быть природные, атакже синтетические органические полимерыПрименяемые этиленненасыщенные мо 15номеры имеют ФормулуСИ =С-Э2-диаэонийхлорид)фенил аминная, акрилоилоксильная, низшая алкилоксикарбонилоксильная или бензолсульфонилоксильная группа;Х - кислород или Нйь , где й, -водород или алкил С - Су - алкилен Св- СЗП - целое число, 1 или 2;Х - галоидацетильная, 2-(4,б-дихлор)-5-триазинильная, и -толуолсульфонильная, И в (галоидметил)-бен- .;эоильная или цианильная группа;К - Х, при условии, когда Х"И -толуолсульфонильная группа, то Х - 45кислород.Предпочтительным для образованиясвязей являются мономеры и полимеры,содержащие эпоксидные, галокарбонильные и галометилкарбонильНЫе группы. 50Особенно предпочтительными являютсяте полимеры, которые содержат реакционноспособные мономеры 2,3-эпоксипропилметакрилат (глицидилметакрилат),2,3"эпитиопропилметакрилат, метакрилоил хлорид и .бромацетилгидроксизтилметакрмлат,В этом случае, когда мономеры и полимеры содержат нереакционноспособныеФункциональные группы, когда например, В гидроксильная группа или 2 водород в мономере Формулы 1 , то этиФункциональные группы могут быть переведены в,реакционноспособные заместители известными способами. Это требует использования полифункциональ ного, иизкомслекулярного реагеита.Таким образом, когда Впредставя,.етсобой гидроксил;11 ую группу в формуле1то карбоксильиые группы моиомераили полимера могут быть активированепри помощи реак 1;ии с соответствующим1 оаа 1 ЕНТОМ аКТИБИРУЮЩИМ КаРЬОКСИПСИЫЕгруппы та 1.И 1 как карбодиимидр иапример, дие 1 иклогексилкарбодиимид илиэтилморфолинокарбодиимид; М -зтил-фенилизоксазолин-сульфоиат (реактив Будворда); кетенимины, такие какпентаметиленкетен циклогексилимин;простые ацетиленовые эфиры, например,этоксиацетилен; гексагалоциклотрифосфатриазие 1 ыр й -гидроксифтальимид или(4 -гидроксисукцинимид и другие реактивы, используемые для образованияпептидной связи. Когда в формуле 1водород, то гидроксилее 1 ые группымономера или 11 олимера могут 11 ереведеиы в активированное состояние припомощи стандартных методов, предусматривающих обработку сое,Еииеиием формулы Е - галлоид и, особенно бромацетилбромидом, цианогенбромидом и 2-амино,6-дихлор,3,5-триазином.Процесс иммобилизации применяютк микробным клеткам, таким как бактерии, дрожжи, актиномицины и грибки,Предпочтительными клетками являютсятакие клетки, в которых первичная ферментативная система представляет собойоксидоредуктазы, особенно такие, какоксидаза глюкозы, которая не требует.решения проблемы растворимости субстрата, гидролазы, такие как б-амилазы и пептидазы, и особенно ацилазапенициллина; лиазы, предпочтительновызывающие разрыв углерод - кислороднь 1 х связей, и особенно такие, как фенилаланинаммонийлиаза и аспарат аммонийлиаза, которые вызывают расщепление по .связям углерод-азот; и изомеразы, такие как рацемазы, зпимеразы,1 цис-транс-изомеразы, и особенно изомеразы глюкозы. Предпочтительными видами бактерий являются;Рзецбоп 1 опаь, хаце,Иагпопаь;Асе 1 оьас 1 ег, А 6- со 61 депе ь; ге,ауоЬас(ег 1 цп 1, ЕьсИег 1 сИ 1 а, АсгоЬасег, Егю 1 п 1 а,зеЕгас 1 о; Рго 1 ець,ААсгососсц ь, е агЕ 1 па,:Баско Ьас 1 И ць, Вас 1 СС ц ь, цосагД 1 а, Мгер 1 оп 1 сеь, Согзпе Ьас(ег 1 оп 1.Предпочтительными грибковыми и дрожжевыми культурами являются:)(Иодо 1 гцйа,ЗЪобоьрог 1 йцгп, ЬрогоЬобогпч -сеь, Мцсог, Гоьаг(отп,реп 1 с 1 се,1 цп 1, АьрегрССоь,Иопеге Иа,ЯИ 1 орць, 5 ассИагогпсеь,СопЖо Ьо 6 ць, Вьь осЫ аепь, Сап й 1 йа, СИае 1 огп 1 ц т,Тг 1 сИодегтпа,берог 1 а,сорг 1 пць, НцгпцсоГа.и Тг 1 сИоьрогопПредпочтительным актиномицетом является микрополиспора. Особенно предпочтительными штаммами являются: Еьспег 1 сИ 1 а сос 1,Васьег 1 от сооаегць,рго 1 ець геИдег, Чпойо 1 го Юа сггдс 1 с 1 ь, Реп 1 С 1 с 81 цв сИпчьоц епцгп и Аьрег 4 ВЮоь п 1 д егСостав полимера может меняться вшироких пределах, но предпочтительныйсостав, определяемый молярным процентным содержанием всего мономера, составляет от 15 до 90 реакционноспособного по отношению к клетке мономера, от 0 до 60 сомономера и от 10до 40 мономера, образующего поперечные связи. Эти пропорции яьляются предпочтительными, независимо от того,.связываются ли клетки с мономером илиполученным предварительно полимером.В некоторых случаях клетки обрабатываются полифункциональным сшивающимреагентом для понижения потерь Фермента иэ клеток. Предполагают, чтоодин класс полифункциональных реагентов приводит к образонанию поперечныхсвязей на клеточной поверхности посредством взаимодействия с аминогруппами клеточной мембраны, в результате чего существенно понижается пористость мембраны; другой класс обеспечивает такой результат за счет активации карбоксильных групп, присутствующих в мембране, которые затем нзаимодействуют с аминогруппами мембраны и образуют.амидные связи, Типичными примерами первого класса соединений являются такие реагенты, как альдегид пировиноградной кислоты, глиоксаль, гидроксиадипальдегид, хлорангидрид циануровой кислоты, тетраазотированный Образование ковалентных связей клеток и реакционноспособного полимера, или связей клеток с реакционноспособным мономером с последующей полимериэацией или сопольмериэацией, проте, кает в водной среде. Температура реакции образования связей с полимером или мономером, или реакции полимери- зации после образования связей с мономером, может меняться в широком ди-. апазоне, но предпочтительный диапазон составляет от 5 до 50 С, и особенноопредпочтительный от 10 до 30 С. Время, необходимое для образования связей, будет зависеть от выбранной системы и температуры образования связей, но обычно составляет от 0,5 до 35 час 1 предпочтительное время образования связей с полимером составляет от 15 до 30 час, тогда как время образонания связей с мономером - от 1 до 5 час.20 Процесс полимериэации обычно протекает в пределах от 1 до 6 час, Весовое соотношение полимер-клетки (сухой вес)может широко меняться, но предпочтительное отношение находится в пределах от 0,1 до 25, особенно от 0,5 до .4. Когда клетки связаны с реакционноспособным мономером, начинается процесс последующей полимеризации, протекающий в водной среде в присутстнииодного или более сомономера или безнего и бифункционального мономера,приводящего к образованию поперечныхсвязей, и инициирующей системы. Могутбыть взяты любые из сомономеров илимономеров, обеспечивающих образованиепоперечных сняэей, и инициирующих систем, используемые для проведения полимериэации такого типа и не приводящие к снижению ферментативной актив"ности.Подходящими сомономерами являются,например, акриловые, А -хлоракриловые, метакриловые кислоты и глициди-ловые, алкильные сложные эфиры на основе низших алкилов, К, М в (дизаме"щенные)аминоалкильные сложные эфиры,амиды, замешенные низшим алкилом амиды, амиды с.метилольными заместителями, М -монозамещенные аминоалкиламиды, И, М -дизамещенные аминоалкиламиды, стирол, бутадиен и иэопрен. Вкачестве предпочтительных сомономеровможно назвать стирол, акриловую кислоту, (2-гидрокси-(1- (4-метил-пиперазинил)-пропилметакрилат и, особенно, метилметакрилат,Может быть использован целый рядмономеров, образующих поперечные связи и придающих конечному полимеру характер пространственной сетки и водонерастворимость, например, акриловыемономеры или олефиновые соединения идругие мономеры, известные в этой области. Примерами таких мономеров являются 1-3-бутилен диакрилат, этилен гликоль диметакрилат, 1,3-бутилен диметакрилат, 1,б-гексаметнлендиакрилат, этилендиакрилат, диэтиленгликоль диметакрилат, К, Й -метиленбисакриламид, неопентилгликоль диметакрилат, 1,1,1 - -триметилолэтан триметакрилат и дивинилбензол, Предпочтительным мономером, образующим поперечные связи, является Х,й -метиленбисакриламид.Реакции полимеризации и сополимеризации инициируютсясвободными радикалами. Пригодными инициирующими свободнорадикальные процессы системами являются такие системы, которые генерируют свободные радикалы и обеспечивают протекание реакций полимеризации и сополимеризации с соответствующей скоростью в мягких условиях, что обусловлено термической чувствительностью клеточных ферментов, По этой причине предпочтительными являются окислитель- но-восстановительные инициирующие системы. Примерами таких систем являются перекисные соединения, такие как персульфаты аммония, натрия или калия, перекись бензоила и ди(втор,бутил) - -пероксидикарбонат в сочетании с восстановительным агентом, таким как тиосульфат натрия, метабисульфат натрия, гексагидрат ферроаммоний сульфата, диметиламинопропионитрил или рибофлавин. Предпочтительной инициирующей системой являетсясистема диметиламинопропионитрилперсульфат аммония.о-дианизидин, бис-диаэатированный бензидин, 1,3-дифтор,б-динитробенэол,толуол 2,4-диизоцианат и, особенно,глутаальдегид, тогда как во второйкласс входят такие соединения, как 5этилхлорформиат и водорастворимые карбодиимиды, например, 1-этил-(3-диметиламинопропил)-карбодиимид.Обработку клеток проводят передприсоединением к реакционноспособномумономеру или полимеру. Такую обработку проводят в водной среде. Эффективную обработку клеток можно проводитьв широком температурном диапазоне, нопредпочтительным диапазоном являетсяинтервал от 5 до 50 С, и .особеннооот 10 до 30 С В зазисимости от температуры и природы используемого агента такая обработка требует обычно от0,5 до 10 час, предпочтительно, когдаона протекает в течение 2-4 час. Количество используемого реагента можетсущественно изменяться обычно оноколеблется от 1 до 50 вес. клеток(сухой вес", предпочтительно в . от 5до 5 вес,. 25Предлагаемый процесс иммобйпиэациимикробных клеток водонерастворимымполимером, протекающий с образованиемхимических ковалентных связей, с дополнительной обработкой, необходимой 30для минимизации потерь клетками фермента, приводит к получению стабильной системы имиобилиэованного Фермента, не требующей вьтеления требуемогофермента. Вследствие устойчивости системы н легкости Фильтрации полученныйпродукт можно эффективно использова"ьв водных каталитических химическихпроцессах, проводящихся либо периодически с повторным использованием смеси, либо непрерывно,Применяемые в споссбе в качествеисходных веществ соединения могут бытьполучены известными способами. Продукты ферментативных превращений выделяют известными методами.П р и м е р 1. К 80 г глицидилметакрилата и 1 л воды добавляют при перемешивании 30 г И, И -метиленбисакриламида. После перемешивания смеси втечение 15 мин при комнатной температуре добавляют 10 г метилметакрилата, смесь охлаждают до 5 С и в течение 15 мин через охлажденную смесьпропускали азот. Затем добавляют 20 млдиметиламинопропионитрила и 2 г персульфата аммония. Смесь, находящуюсяпод атмосферой азота, перемешиваютпри 10 фС до начала процесса полимеризации, затем дополнительно час притемпературе окружающей среды, и выстаивают в течение 2 час. К образовавшемуся осадку добавляют 750 мл воды, и смесь интенсивно перемешивают,чтобы собрать полимер, Осадок отфильтровывают, промывают водой и сушат навоздухе, в результате получают 120 г полимерного материала, белого цвета.Ферментативную культуру А п 1(тег /Мй Яс-ЗР 11 гег Сц 31 цге Ъ - 2454 выращенную в азробных условиях при33 С и рН 5,8-7,0 на глюкозе, отфильтровывают, а клетки промывают водой иполучают полусухую пасту. Клетки (250 г55 г сухого веса) поместили в раствор,содержащий 22 г 25-ного водного глутаральдегида в 1000 мл воды, рН сус"пензии довели до 6,2 и перемешиваютв течение 1-3/4 час при комнатной температуре, Осадок отфильтровывают ипромывают водой, в результате чегополучают 104 г сырых обработанных клеток,.обладающих 76 активностью от начальной активности оксидазы глюкозы.Суспензию 32 г сырых обработанныхклеток и 16 г глицидилметакрилатногополимера в 240 мл воды перемешивают втеченйе 30 час при комнатной температуре, а затем отфильтровывают. Осадокпромывают водой, получают 126 г сырыхиммобилизованных клеток, обладающих58 активностью оксидазы глюкозы исходных необработанных клеток,П р и м е р 2. К суспензии 600 млсырых обработанных клеток А.п 1 дег полученных как и в примере 1 (активностьоксидазы глюкозы 23 единицы/100 мг),в 20 .мл ацетонитрила добавляют одновременно 600 мг метакрилоил хлоридаи 400 мг триэтиламина, Смесь перемешивают при комнагной температуре в течение 2 час, затем помещают в 20 млводы "(конечное значение рН 6,03). Кводной смеси в атмосфере азота, добавляют 1,3 г М,М -метиленбисакриламида, 750 мг метилметакрилата и 300 мгакриловой кислоты. рН смеси доводят до6,7 и обрабатывают 0,5 мл диметиламинопронионитрила и 250 мл персульфатааммония. Через 2 час от начала реакции смесь дополнительно обработали150 мг персульфата аммония и перемешивают в течение часа. К реакционнойсмеси добавляют равный объем воды,смесь отцентрифугируют. Осадок отфильтровывают и промывают водой, получают32,25 г сырых иммобилиэованных клеток,обладающих 78 активностью оксидаэыглюкозы нативных клеток. П р и м е р 3. 47,3 г сырых иммобилизованных клеток из примера 1 помещают в 100 мл водного раствора, содержащего 10 г глюкозы, смесь перемешивают 21 час при комнатной температуре с аэрацией. В конце реакции .остаточная активность фермента 75 от исходной, а конверсия глюкозы до смеси глюконовой кислоты и 0 -глюконолактона составляет 99Процесс окисления можно проводить, используя 30 г сырых иммобилиэованных клеток примера 2 в 20 мл водного раствора, содержащего 2 г глюкозы, при этом достигают сравнимые степени конверсии субстрата и инактивации фермента,П р и м е р 4. ьульонную ферментативную культуру ,го 1 ецв еИег 1(АТСС9250,%11 Ег СоЕ 1 ГЭ ) 18470-76-60,выращенную в аэробных условиях при28 С и рН 6,8-7,0 на молочном казеинецентрифугируют, клетки смешивают сводой, получают полусухую пасту, Ксуспензии сырых клеток (7,5 г сухоговеса) в 100 мл воды добавляют 4 г 25 ного водного глутаральдегида. СмесьрН а 7,0 перемешивали в течение 3 часа затем центрифугируют. Обработанныеклетки повторно суспевдируют в 100 млводы, а затем при перемещивании доба-вили 7,5 г глицидилметакрилатного полимера полученного в примере 1, Смесьс рН7,0 перемешивают при комнатнойтемпературе в течение 30 час, ОсадокотФильтровывают, промывают водой и 20хранят в виде влажной массы до использования. Иммобилизованные клетки содержат 65 активности нативныхклеток,что оценивалось по скорости конверсиипенициллина Я в б-аминопеницилиновую 25кислоту.П р и м е р 5. К суспензии 20 г(5,0 г сухого веса) иммобилизованныхклеток Рг о 1 е о в г е 11 де гпримера 4в 500 мл воды при рН 8,0 и температуре 37 С добавляют 5 г калиевой соли пенициллина, рН суспензии поддерживают на уровне 8,0 при помощи доэированного введения 1 н, йаОН , реакция гидролиза заканчивалась по истечении 3 час. Иммобилиэованные клетки отфильтровывали, промывали водой и хранили вплоть до их дальнейшего использования в виде сырой лепешки, рН Фильтрата доводят до 2 при помощи 2 н. НС 6 , экстрагируют 40 этилацетатом, рН полученного водного слоя доводят до 4,3 при помощи 2 н. МаОН, упаривают и охлаждают, врезультате чего получают белое кристаллическое вещество. кристаллы отфильт ровывают, промывают водойи высушивают на воздухе, в результате чего получают 2,17 г (выход 75) чистой б-аминопеницииновой кислоты. Иммобилиэованные клетки характеризуются 50 активностью 60 ацилазы пенициллина исходных иммобилиэованных клеток через .20 циклов,П р и м е р б. К перемешиваемой смеси, находящейся под атмосферой азота, 3,6 г бромацетилгидроксиэтилметакрилата в 15 мл воды добавляют 375 мг .М, Н -метиленбисакриламида, Смесь охлаждают до 5 С и обрабатывают 0,25 мл диметиламинопропионитрила и 38 г персульфата аммония. Смесь медленно перемешивали при комнатной температуре до начала реакции полимеризации. Затем мешалку останавливают, реакционр ную смесь выстаивают при комнатной температуре в течение 2 час, Образовавшуюся суспензию разбавляют 25 мл воды 65 и фильтруют. Осадок промывают водой исушат на воздухе в результате чего получают 3,7 макрочастиц полимера.Сырые клетки Рго 16 ць ге 11 де г 1,выращенные и выделенные как и в примере 4 (10 г, 2 г сухого веса) поместили в раствор , содержащий 0,8 г25-ного водного глутаральдегида в50.мл воды, рН суспензии доводят до7,0 перемешивают 3 час при комнатнойтемпературе и центрифугируют. Обработанные клетки смешивают с 50 мл водыдо получения консистенции полусухойпасты,Суспензию 10 г обработанных клетоки 20 г бромацетилгидроксиэтилметакрилатного полимера в 120.мл воды перемешивают 30 час при комнатной температуре и рН 7,0. Смесь отфильтровывают, и осадок промывают водой, получают 36,8 г сырых иммобилизованныхклеток, характеризующихся 75 активностью ацилазы пенициллина исходныхнеобработанных клеток.П р и м е р 7. К суспенэии 46 гсырых иммобилиэованных клеток примера б в 500 мл воды, рН = 8,0 при температуре 37 С добавляют 5 г калиевойсоли пенициллина Ц, рН суспензии 8,0при помощи дозированного введения1 н. ЙаОН . Иммобилизованные клеткиотфильтровывают, промывают водой ихранят до их использования в виде сырого куска. рН фнльтрата доводят до2 при помощи 2 н. НС 6 и экстрагируютэтилацетатом, Полученный водный слой доводят до рН 4,3 при помощи 2 н МаОН, упаривают и охлаждают, получают кристаллическую б-аминопенициллиновую кислоту.П р и м е р 8. Суспензию 25 г сырых обработанных клеток А. й 1 ДСг из примера 1, и 2 г глицидилметакрилата в 60 мл воды перемешивают при температуре 7 С в течение 17 час. Затем эту суспензию добавляют к смеси 2;2 г Н, М -метиленбисакриламида, 2 мл стирола, 450 мл метилметакрилата, 0,5 мл диметиламинопропионитрила и 1,5 г 12-гидрокси- (1- 4-метилпиперазинил)- -пропил 1-метакрилата в 40 мл воды при рН 6,8. Смесь в атмосфере азота, обрабатывают 200 мг персульфата аммония и перемешивают 3 час при комнатной температуре. Осадок, отфильтровывают и промывают водой, в результате чего получают 43,6 г сырых иммобилизованных клеток, характеризующихся 75-ной активностью оксидаэы глю г козы исходных необработанных клеток.П р и м е р 9. 28,3 г сырых иммобилизованных клеток из примера 8 помещают в 200 мл водного раствора, содержащего 20 г глюкозы, и смесь перемешивают в течение 21 час при комнатной температуре с аэрацией. Выход смеси глюконовой кислоты и Ю -глюконолактона 80 Реакционную суспензиюотфильтровывают, осадок промывают водойполучают 28 г сырых иммобилизованных клеток, характеризующихся 82 ной активностью от исходной активности фермента. П р и м е р 10, Суспензию 5 г сырыхклеток РгоСеоь ге гт д е г 1, выращенных и выделенных как и в примере 4, 10и 10 г глицидилметакрилатного полимера примера 1 и 65 мл воды перемешивают 24 час при комнатной температуре.Смесь отфильтровывают, и фильтрат промывают водой, в результате чего получают 26,9 г сырых иммобилизованныхклеток, характеризующихся 62-ной активностью от начальной активностиацелазы пенициллина.25 г иммобилизованных клеток (1 г 20сухих клеток) помещают в раствор, содержащий 0,4 г 25-ного водного глутаральдегида в 50 мл воды. рН суспензии довели до 7,0 и суспензию перемешивают 3 час при комнатной температуре, Суспензию отфильтровывают, и осадок промывают водой, в результате чегопслучают 23,2 г сырых обработанныхиммобилизованных клеток, характеризующихся 79-ной активностью ацилазыпенициллина от активности необработанных иммобилизованных клеток,П р и м е р 11, К суспензии 12 гсырых обработанных иммобилизованныхклеток, полученных в примере 10, в100 мл воды гри рН 8,0 и температуре37 С добавляют; 1 г калиевой соли инициллина 6. рН реакционной смеси поддерживают 8,0 добавлением 1 н. ОООНМатериал иммобилизованных клеток фильтРуют, промывают водой и хранят в видесырого куска вплоть до дальнейшегоиспользования. рН Фильтрата доводитсядо 2 2 н. НС 1 , Фильтрат экстрагируется зтилацетатом. Образующийся водный слой доводят до рН 4,3 при помощи 452 н. НО Он, упаривают и охлаждают ярезультате чего получают кристаллическую 6-АПК.П р и м е р 12. рН суспензии клетокА И 1 ДС г , выращенных и выделенных как 50и в примере 1 (20 г, 4 г сухого веса),и 8 г глицидилметакрилата в 100 мл воды доводят до 7,5 и суспензию встряхивают при комнатной температуре 18 час,Добавляют 1,5 г М, М -метиленбисакриламид и полученную суспензию в атмосфере азота перемешивают 15 мин, затем охлаждают до 5 С, обрабатывают150 мг персульфата аммония и 1 мл диметиламинопропионитрила, перемешиваютпри температуре окружающей среды Зчас60Продукт реакции отфильтровывают и промывают водой, получают 71 г сырых иммобилизованных клеток, характеризующейся 62-ной активностью от началь)ной активности оксидазы глюк лы,65 18 г иммобилизованнь.х клеток (1 и сухого веса) помещают в раствор, со - держащий 0,4 г 25-ного водного глутаральлегида в 100 мл воды, рН суспензии доводят до 7,0 и суспензию перемешивают в течение 3 час при комнатной температуре. Осадок отфильтровывают и промывают водой, получают 17,3 г сырых обработанных иммобилизованных клеток, содержащих 75 активности оксидазы глюкозы, присутствующей в иммобилизованных клетках перед обработкой глутаральдегидом.П р и м е р 13. 1.4 г сырых обработанных иммобилиэованных клеток, полученных .в примере 12, помещают в 15 мл водного раствора, содержащего 1,5 г глюкозы, и смесь в условиях аэрации перемешивают 21 час при комнатной температуре, в результате чего достигают конверсии в глюконовую кислоту.П р и м е р 14. Клетки ЯЬойо 1 огц 1 а огос 1 Е 1 в С НйН41091,Р 1 яег СоЕ 1 Г 06521) выделили из бульонной культуры, выращенной в аэробных условиях при 28 С и рН 6,8-7,0 на глюкозеопутем центрифугирования. 50 г промытых клеток в 250 мл воды обрабатывают 5 г глицидилметакрилатного полимера полученного в примере 1. Смесь перемешивают при комнатной температуре 20 час. Суспензию отфильтровывают, осадок промываю-. водой, получают 63 г сырых иммобилизованных клеток, содержащих 49 Ъ исходной фенилаланин аммоний - лиазной активности. П р и м е р 15, Суспензия 14,74 г сырых иммобилизованных клеток, полученных в примере 14,в 30 мл воды, 2,25 г транс-коричной кислоты, 652 г хлористого аммония и 3,3 мл концентрированной гидроокиси аммония, рН суспензии 9,5, Смесь встряхивают 18 час при 37 С, получают Ь -фенилаланина,овыход 90 Ъ в расчете на свободную коричную кислоту, Продукты реакции отФильтровывают и промывают водой, в результате чего получают 14 г сырых иммобилизованных клеток, содержащих 77 исходной Фенилаланин. аммоний лиазной активности. ) -Фенилаланин выделяют из Фильтрата стандартными методами.П р и м е р 16. Суспензия 40 г промытых клеток Яио 3 о 1 огоба цгос 1 С 1 ь выращенных и выделенных как описано в примере 14, 8 г глицидилметакрилата в 80 мл воды, рН суспензии доводят до 7,2, смесь перемешивают при комнатной температуре 1,5 час, Добавляют 1,5 гЙ,)Ч -метиленбисакриламида, перемешивают в атмосфере азота. 10 мин, затем охлаждают до 5 С, обрабатывают 150 мл персульфата аммония, 1 мл диметиламинопропионитрила, перемешивают при комнатной температуре три часа.Суспензию разбавляют водой и отфильтровывают, Полимерный осадок промывают водой иполучают 62,3 г сырых иммобилизованныхклеток, содержащих 44 исходной Фенилаланин аммоний - лиаэной активности.П р и м е р 17. Суспензию 15 г сырых иммобилизованных клеток полученных в примере 16 и 30 мл воды, 1,12 гтранс-коричной кислоты, 320 мг хлористого аммония и 1,6 мл концентрированной гидроокиси аммония, рН суспензии 9,5. Смесь встряхивают при 37 С 0ф 118 час, получают-Фенилаланин, вы-ход которого сравним с выходом-Фенилаланина в примере 15.П р и м е р 18. Суспензию 15 г сырых клеток Рго 1 еиь геФСег 1 выра 15щенных и выделенных как описано в примеге 4, и 30 г глицидилметакрилатногополимера полученного в примере 1 вво"дят в 100 мл воды, перемешивают прикомнатной температуре 18 час, рН 7.Затем суспензию центрифугируют, оса 20док промывают водой, в результатечего получают 100 г сырых иммобилизованных клеток, содержащих 100 ацилазы пенициллина исходной активности.25К суспензии 25 г сырых иммобилиэованных клеток в 70 мл воды при рН 8,0и 37 С добавляют 1 г калиевой солипенициллина . Реакция гидролиза, протекает 3 час при рН 8,0 введением 1 н. 30МОНСуспензию отфильтровывают, им.-.мобилизованные клетки промывают водойи хранят в виде сырого куска вплотьдо дальнейшего использования. Однакоэффективность этих клеток с точки зре-,ния получения 6-аминопенициллиновойкислоты была ниже, чем в примере 4,так как активность ацилазы пеницилли"на составила только 15 активности исходных клеток уже через 2 цикла,П р и м е р 19. К 25 г 2-гидроксиэтилметакрилата в 100 мл воды добав"ляют 12,5 г бромистого дициана, растворенного в 100 мл воды. рН смеси немедленно доводят до 11 при помощи 5 наОН в результате чего температура 45поднялась до 45 оС, реакцию поддерживали при этом значении рН до окончания реакции Затем смесь охлаждают докомнатной температуры, доводят рН до6,5 и обрабатывают суспенэией 50 г 50высушенных замораживанием клеток РгоТЕ о ь ге 11 е г 1, предварительно выра щенных и выделенных как и в примере 4,в 500 мл воды, Образовавшуюся суспензию перемешивают в течение 45 мин. За тем добавляют 25 г акриламида и 2,5 гя, Н "метиленбисакриламида, и суспензию перемешивают 15 мин, охлаждают до4 С и обрабатывают 4 мл диметиламинопропионитрила и 425 мг персульфатааммония. Смеси дают нагреться до комнатной температуры и вызреть в течение часа. Затем смесь гомогенизируют,используя смеситель Уоринга, и центрифугируют. Гелеподобный центрифугатсуспендируют в воде, снова центрифу 65 гируют, промывают водой и высушиваютзамораживанием, получают 112 г сухихиммобилиэованньи клеток, содержащих19 ацилазы пенициллина начальной активностиП р и м е р 20. К суспензии 20 гсырых клеток Р г О 8 ц з г е 1 1 Е Г 1,выращенных и выделенных как описано впримере 4, в 80 мл воды добавляют 1 г25-ного водного глутаральдегида и10 г глицидилметакрилата. рН суспенэии доводят до 6,8, и суспензию перемешивают при комнатной температуре.2 час. Затем смесь в .атмосфере азотаобрабатывают 1,9 г Й, 8 -метиленбисакриламида и 2 мл диметиламинопропионитрила, рН доводят до 7 и обрабатывают 20 мг персульфата аммония. Образовавшуюся суспеизию перемешивают1/2 час, а затем дают ей вызреть прикомнатной температуре в течение 1"1/2 час, Осадок отфильтровывают и промывают водой, получают 81,3 г сырыхиммобилизованных клеток, содержащих54 исходной активности ацилазы пенициллина необработанных клеток,Сырые иммобилизованные клетки используют для превращения калиевой соли пенициллина-Ц в 6-аминопенициллиновую .кислоту, как описано в примере 7.П р и м е ю 21. Ьасег 1 от сайачегцз АТОС 97 ЬО, Р 11 т.аг Сц 6 Ьцге, Р 2 24016) бульонная культура, выращенная в аэробных условиях при. 28 ф С и рН 6-8 на субстрате из гидролиэованного протеина, центрифугируют,и клетки смешивают с водой для получения полусухой пасты. К суспензии сырых клеток (7,5 г сухого .веса в 100 мл воды добавляют 4 г 25-ного водного глутаральдегида. Смесь пер.АаФфивают в течение 2 час при рН 7, а затем цей- трифугируют. Обработанные клетки вновь суспендируют в 100 мл воды, при перемешивании добавляют 7,5 г.глицидилметакрилатного полимера полученного в примере 1. Смесь перемешивают при рН 7 и комнатной температуре в течение 30 час. Осадок фильтруют, промывают водой и до дальнейшего использования хранят в виде сырого куска.П р и м е р 22. 120 г Фумаровойкислоты добавляют к 140 мл концентрированной гидроокиси аммония. рН смеси доводят до 8,5 при помощи гидроокиси аммония, и объем реакционной смеси доводят до 600 мл, Добавляют иммобилизованные клетки, полученные в примере 21, содержащие 7000 единиц активности аспартат аммоний - лиаэы, и смесь перемешивают при 37 цО 4 час.Суспензию отфильтровывают, рН фильтрата доводят до 2,8 при помощи серной кислоты, в результате выпадает аспарагиновая кислота.608479 15 16 формула изобретения Составитель А.БочаровРедакто Р.Антонова Тех е Э.Ч ик Ко екто А.Лакида Заказ 2675/21 Тираж 559 Подписное ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий 113035 Москва ЖРа сная наб.4 5 Филиал ППП Патент, г, Ужгород, ул. Проектная, 4 1. Способ иммобилизации микробных Клеток, о т,л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью обеспечения стабильности системы и предотвращения потери ак, тивности микробные клетки подвергают взаимодействию с полимером, содержащим реакционноспособные группы или с . полимеризуеьым этиленненасыщенным мо-: номером, содержащим реакционноспособиые группы для образования ковалентных связей между микробными клетками и водонерастворимыми частицами полимерной матрицы.2. Способ по п.1, о т л и ч а ю - щ и й с я тем, что применяют исходные соединения, содержащие заместители, такие как эпоксидные группы, галоидкарбонильные группы и галоидметилкар" бонильные группы, 203. Способ по п.1 или 2, о т л и - ч а ю щ и й с я тем, что применяют микробные клетки, содержащие один иэ ферментов, включая оксидаэу глюкозы, ацилаэу пенициллина, фенилаланин ам монийлиазу, аспартат аммонийлиазу.4Способ по пп.1-3, о т л и ч а ющ и й с я тем, что,микробные клетки подвергают обработке полифункциональным реагентом, образующим поперечныесвязи,5. Способ по п.4, о т л и ч а ю -щ и й с я тем, что обработку реагентом, образующим поперечные связи проводят до реакции образования ковалентных связей с полимером или мономером,6. Способ по п,5, о т л и ч а ющ и й с я тем, что в качестве реагента для образования поперечных связейберут глутаровый альдегид.7. СПособ по и;6 о т л и ч а ющ и й с я тем, что микробные клеткиподвергают взаимодействию в воднойсреде с глутаровым альдегидом, затемв водной среде с глицидилметакрилатомдля образования ковалентных связей изатем мономер полимеризуют в присутствии М, Н -метилен-бисакриламида идиметиламинопропионитрил персульфатааммония. Источники информации, принятые вовнимание при экспертизе: 1,В 1 ое с Ь в о Е. В 1 о е л г т. 15,565, 1973.