Штамм бактерий rноdососсus rноdоснrоus продуцент нитрилгидратазы

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 731814 А 1 19) (И 8, С 12 Р 13/О с)5 С 12 РИ ГКНТ ССС ЕН относится к микробио ышленности и касаетс о штамма, обладающег гидратазной активно Изобретени логической про получения ново высокой нитри стью,трансиламид: гп й 774, гогорЬ 1 з ые а ссег сЬНитрилгидующий проце оновых кислот-1.ммов являетактивность ае штамма я активность а 38,5 ед,ОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ ОПИСАНИЕ И ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВ(71) Саратовский филиал Всесоюзного научно-исследовательского института генетикии селекции промышленных микроорганизмов и Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекциипромышленных микроорганизмов(57) Использование: биотехнология, Сущность изобретения: получение нового штамаза - фермент, катализигидролиза нитрилов карамиды,Известны микроорганизмы, продуциру ющие фермент нитрилгидратазу, относя щиеся к родам СогупеЬассег 1 цв, Косагс 1 а Вгеч Ьассег 1 цв, Вас 1 цз, Вассегс 1 цв М 1 сгососсцз, Рзецбцвопаз, РЬо(ососсцз. ма бактерий - продуцента фермента нитрилгидратазы, выделенного из почвы производства акрилонитрила, с использованием в качестве селектирующего агента изобутиронитрила. Штамм ВЬобососсцз гЬос 1 осЬгоцз ВКПМЯ - 926 обладает следующими признаками: грампозитивный, неподвижный, спор не образует, некислотоустойчив, аэроб. Клетки в возрасте 18 - 20 ч образуют длинные слабоветвящиеся нити, которые через 48-72 ч распадаются на палочковидные и кокковидные элементы. Штамм ВЬосососсцз гЬососЬгоцз 926 обладает высокой активностью нитрилгидратазы, достигающей 140 ммоль мг/мин в отношении изобутиронитрила, 220 ммоль/мг/мин в отношении ацетонитрила, 150 ммоль/мг/мин в отношении акрилонитрила, Штамм ВЬосососсцз гЬососЬгоцз ВКПМЯможет быть использован в биотехнологическом процессе получения акриламида и других амидов карбоновых кислот. 3 табл. 1 ееаьОдним из примеров использования это С 0 о фермента является получение акрилами-ъ а из акрилонитрила. Известны штаммы, способ формации акрилонитрила СогупеЬассег цв М 771, СогупеЬ Мосагс 1 а М 775, Рзец(овопа В 23, ВЬосососсцз гЬодосЬгоцзНедостатком данных шта ся низкая ферментативная нитрилгидратазы, В случ СогупеЬассепцв М 774 удельн нитрилгидратазы не превышаИзвестен штамм Рзеобовопаз сЫогогарЫз В 23, который при выращивании на среде, содержащей аминокислоту :цистеи н (2 г/л), проявлял ферментативную активность 105,7 ед,Недостатком данного штамма является использование в культуральной среде дорогостоящей аминокислоты,Наиболее близким к изобретению по технической сущности является штамм Ат, мутант Рзецбогпопаз сЫогогарЫз В 23, который обладает удел ь ной нитрил гидратазной активностью 141 ед,Недостатками данного штамма являются использование в среде культивирования дорогостоящих аминокислот :пролина и 1: цистеина, дробное введение индуктора - метакриламида.Целью изобретения является получение штамма с более высокой нитрилгидратазной активностью, не требующего использования аминокислот при выращивании, культивирование на простой синтетической среде,Заявляемый штамм ЙЬобососсцз гпобоспгооз М 8 депонирован под номером 5-226 и характеризуется следующими морфолого-культуральными и физиолого-биохимическими признаками,Морфологические признаки: штамм грамположительный, неподвижный, спор и капсул не образует, некислотоустойчив, аэроб. Клетки в возрасте 18 - 20 ч образуют длинные по 20 мкм, слабо ветвящиеся нити, которые через 48 - 72 ч распадаются на палочковидные и кокковидные элементы.Палочковидные клетки имеют размеры 0,9-1,2 х 2,0-20,0 мкм. Деление клеток происходит как по раскалывающемуся, так и по сгибающемуся типу. В протоплазме клеток видны внутриклеточные включения в виде зерен (гранулярность протоплазмы).Культуральные свойства; при росте на мясопептонном агаре штамм образует круглые гладкие колонии диаметром 1 мм (48 - 72 ч), поверхность сухая, матовая, розового цвета, При росте на мясопептонном бульоне образует пленку и осадок, Лакмусовое молоко не изменяет.Физиологические свойства: штамм редуцирует нитраты, Тест с метиловым красным, реакция Фогес-Проскауэра отрицательные, Образует сероводород, Штамм оксида за отрицательный, каталаза- и фосфатазаположительный. Растет при рН 6 - 9, оптимальное значение рН 7,0, при температуре 5 - 45 С, оптимальное значение температуры 30 С, В качестве источников азота использует соединения аммония и нитраты,5 10 15 20 25 30 35 40 45 55 Штамм дает кислую реакцию при росте на глюкозе, фруктозе, сорбите, манните и глицерине. Газообразование ни на одном сахаре не обнаружено. В качестве единственного источника углерода использует инозит, маннит, мальтозу, сорбит, глюкозу, глицерин, лактат, пируват, не использует рамнозу, галактозу. Крахмал и целлюлозу не гидролизует, твин 60 и твин 80 гидролизует. Аденин не утилизирует.Химический состав клеток; в клеточной стенке содержится аезо-диаминопимелиновая кислота, арабиноза и галактоза. Содержится липид А ( СК), характерный для родококков.Чувствительность к антибактериальным препаратам; штамм чувствителен к канамицину, хлорамфениколу, ампициллину, пенициллину, мономициину, тетрациклину, рифампицину.Патогенность: штамм непатогенный.Ферментативную активность определяли с использованием в качестве субстратов нитрилов карбоновых кислот, За единицу удельной нитрилгидратазной активности принимали количество фермента, катализирующего образование 1 мкмоль амида в одну минуту, содержащегося в 1 мг сухого веса клеток.Штамм ЯЬобососсцз гпобосйгооз М 8, ВКПМ 8-926 обладает более высокой активностью нитрилгидратазы (150 ед.) по сравнению со штаммом прототипом Ав(141 ед.) и не требует использования в культу- ральной среде дорогостоящих аминокислот,П р и м е р 1, Выделение штамма Впобососснз гпобоспгоиз М 8, ВКПМ 5-926.Заявляемый штамм был выделен из почвы с производства акрилонитрила. Навеску почвы 1,0 г ресуспендировали в 10 мл физиологического раствора и отстаивали в течение 1 ч, Надосадочную жидкость в количестве 2 мл вносили в среду следующего состава, г;К 2 Н Р 04 0,5 КН 2 Р 04 0,5 М 9304 7 Н 20 0,5 Ре 504 7 Н 20 0,01 Глюкоза 1,0 Изобутиро нитрил 1,0 Вода водопроводная,мл 1000 рН 7,2" 0,2 50 мл суспензии инкубировали в 300 мл колбе Эрленмейера при 28 - 30 С, при круговом перемешивании (число качаний 180-200 мин 1), Через двое суток отбирали 1 мл культуральной жидкости, серийно разводили в физиологическом растворе и высевали на чашки Петри с агаризованной средой (1,5агар-агара) вышеуказанного состава. Посевы инкубировали 48-72 ч при28-30 С, после чего отбирали наиболеекрупные колонии, которые использовали в 5дальнейших исследованиях. Колонии пересевали на чашки Петри с мясопептоннымагаром. Выделенные культуры изучали наспособность к трансформации акрилонитрила в акриламид, 10Микроорганизмы выращивали в течение двух суток на среде выделения,отбирали 5 мл клеточной суспензии, центрифугировали, клетки отмывали 0,01 М фосфатным буфером, рН 7,6, ресуспендировали 15в 2 мл буфера того же состава, содержащегоакрилонитрил в концентрации 1 г/л, Реакцию останавливали добавлением 0,1 мл 1 н.НС 1. Количественное определение акриламида осуществляли методом газожидкостной хроматографии на хроматографеЛХМс пламенно-ионизационным детектором. В качестве неподвижной фазы использовали теорех 400.В результате была выделена культура 25ЯЬобососсив гпобоспгоцв М 8 с высокой нитрилгидратазной активностью.П р и м е р 2. Использование штаммаВЬобососсцз гпобоспгоцз М 8, ВКПМ 3-926для трансформации изобутиронитрила в 30изобутирамид,Полученный штамм КйобососсвзгЬобосйгоцз М 8, ВКПМ 3-926 предкультивировали в колбах Эрленмейера, заполненных на 1/10 часть бульоном Хоттингера в 35течение суток, на качалке (число качаний120 мин ) при 30 С, Культуральную жидкость в объеме 10 мл инокулировали в 1,5 лферментер. Состав среды, г:К 2 Н РОд 0,5 40КН 2 РОа 0,5М 9304 7 Н 20 0,5СОС 12 7 Н 20 0,02Глюкоза 10,0Изобутирамид 2,5 45Дистиллированнаявода, млрНУсловия культивирования:Объем культуральной 50среды, мл 1000Скорость перемешивания, об/мин 600Аэрация, мин 1;2Температура, С 30 55рН 7,2Ферментацию вели при контролируемом значении рН. Подтитровку осуществляли 1 н, НСи 1 н, КОН. Из реакционной среды периодическиотбирали пробы для определения концентрации клеток и их нитрилгидратазной активности, Концентрацию клеток определялифотокалориметрически при длине волны540 нм, толщине слоя 5,07 мм.Активность нитрилгидратазы оценивали следую:цим образом.1 мл культуральной жидкости центрифугировали, клетки отмывали 0,01 М фосфатным буфером, рН 7,6. Буферную емкость изначение рН подбирали экспериментально.Клетки ресуспендировали в буфере указанного состава до значения оптической плотности 0,2 - 0,5 (А 540 нм). К 2 мл клеточнойвзвеси в фосфатном буфере добавляли изобутиронитрил в количестве 25 мкл. Реакциюпроводили при 20 С в течение 10 мин, а затемостанавливали добавлением 0,1 мл 1 н, НС.Бактериальные клетки отделяли центрифу гированием, Концентрацию изобутирамидав надосадочной жидкости анализировалиметодом газожидкостной хроматографии,Удельная активность нитрилгидратазыв отношении изобутиронитрила достигала140 ед,П р и м е р 3. Использование штаммаВйобососсоз гпобоспгоцз М 8, ВКПМ 3-926для трансформации ацетонитрила в ацетамид.Штамм ЯЬобососсцз гпобосЬгоцз М 8,ВКПМ 8-926 подготавливали к процессутрансформации по примеру 2, Активностьнитрилгидратазы оценивали аналогичнопримеру 2. В качестве субстрата добавлялиацетонитрил в количестве 25 мкл.Активность нитрилгидратазы в отношении ацетонитрила достигала 220 ед,П р и м е р 4, Использование штаммаййобососсоз гйобосйгоиз М 8, ВКПМ 3-926для трансформации акрилонитрила в акриламид.Штамм ййобососсцз гпобосЬгооз М 8,ВКПМ Яподготавливали к процессутрансформации как в примере 2. Активностьнитрилгидратазы оценивали аналогичнопримеру 2, В качестве субстрата добавлялиакрилонитрил в количестве 25 мкл.Изменение ферментативной активности в зависимости от стадии роста клетокпредставлена в табл. 1,Активность нитрилгидратазы в отношении акрилонитрила достигала 150 ед,П р и м е р 5, Влияние температуры наактивность нитрилгидратазы штаммаКЬобососсиз гпобоспгоцз М 8, ВКПМ Я.Бактерии Юобососсвз гпобоспгоцз М 8,ВКПМ Явыращивали в течение 70 ч иподготавливали к трансформации по приме1731814 Таблица 1Указанные величины оптической плотности промеряли после соответствующих разведений. ру 2. Образцы с реакционной смесью, содержащие 25 мкл акрилонитрила и 0,04 мг клеток по сухому весу в 2 мл 0,025 М фосфатного буфера, рН 7,6, инкубировали в течение 5 мин при различных температурах. Концентрацию образовавшегося в реакционной смеси акриламида определяли с помощью газожидкостной хроматографии. Изменение активности нитрилгидратазы в зависимости от температуры проведения реакции трансформации представлено в табл. 2.Таким образом нитрилгидратаза из штамма ВЬобососсцз гЬобосЬгооз М 8, В КПМ Яобладает более высокой термостабильностью, чем аналогичный фермент из Рзецботопаз сЫогогарЫз В 23 (температурный оптимум 20 С) и Юобососснз зр. И 774 (температурный оптимум 35 С).П р и м е р 6. Индукция нитрилгидратазы при росте штамма ЯЬобососсиз гЬодосЬгоцз М 8, ВКПМ Яна мочевине,Штамм Юобососсоз гЬобосЬгоцз М 8, ВКПМ Япредкультивировали в колбах Эрленмейера, содержащих бульон Хоттингера в течение суток на качалке при 30 С.10 мл культуральной жидкости инокулировали в колбы Эрленмейера, содержащие 200 мл синтетической среды с различным количеством мочевины. Состав синтетической среды, г:К 2 Н РО 4 0,5 Ма Н 2 РО 4 0,5 М 9304 7 Н 20 0,5 СоС 2 6 НО 0,004 ЕеЯОд 7 Н 20 0,005 Глюкоза 10,0 - 20,0 Дистиллированнаявода, мл 1000 Клетки растили втечение 72 ч при 30 С. Активность нитрилгидратазы определяли по примеру 2, Изменение активности нитрилгидратазы в зависимости от концентрации мочевины в среде представлено в табл. 3,Результаты табл. 3 показывают, что уровень индукции нитрилгидратазы возрастаетс ростом концентрации мочевины в среде иудельная активность достигает максималь 5 ного значения при концентрации мочевины16 г/л.Заявляемый бактериальный штамм М 8,ВКПМ 3-926 на основании таксономического изучения отнесен к виду Юобососсцз10 гЬобосЬгооз. Штамм обладает индуцибельной нитрилгидратазой, осуществляющейгидролиз алифатических нитрилов в амиды,Индукция нитрилгидратазы достигаетсяпри выращивании клеток ЙЬобососсцз15 гЬобосЬгоиз М 8 на минеральной среде сионами кобальта, содержащей в качествеисточника азота и индуктора нитрилы и амиды органических кислот, например изобутиронитрил или изобутирамид, а в качестве20 источника углерода - глюкозу. Максимальная активность нитрилгидратазы (удельнаяактивность 300 и общая активность 2400)наблюдается при использовании в качествеисточника азота и индуктора мочевины ко 25 мерчески доступного соединения, что особенно важно в случае промышленногоиспользования штамма. Еще одним важнымтехнологическим преимуществом испол ьзования штамма КЬобососсцз гЬобосЬгоцз М 830 в качестве катализатора при гидролизе нитрилов является высокая термостабильностьнитрилгидратазы, Максимальная активность фермента (1000 ед,) наблюдается при53 С.35 Штамм Юобососсцз гЬобосЬгоцз МЯ,ВКПМ 3-926 может быть рекомендован какпродуцент фермента нитрилгидратазы и использован в биотехнологическом процессеполучения акриламида и других амидов кар 40 боновых кислот,Формула изобретенияШтамм бактерий ВЬобососсцагЬобосЬгооз ВКПМ 8-926 - продуцент нитрилгидратазы.4510 1731814 Таблица 2 Таблица 3 10 15 20 Составитель С.КозулинТехред М.Моргентал Корректор М,Пожо Редактор Л.Гратилло Заказ 1557 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101