Способ получения 3-гидроксибутиратдегидрогеназы

(19) сн ) ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ ИПРИ ГКНТ СССР ИТЕТКРЫТИ И БР ПИСАНИ Т 14 (48) 05.08.81 7арла Маркса (00) и Ганс Петер Клебе К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬС(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 3-ГИДРОКСИБУТИ РАТДЕ ГИДРОГЕ НАЗ Ы(57) Изобретение относится к биотехнологии и касается способа получения 3-гидроксибутиратдегидрогеназы, которая находит Изобретение относится к биотехнологии и касается способа получения 3-гидроксибутиратдегидрогеназы. который находит применение в клинико-химической диагностике для количественного определения кетонных тел.Известен способ получения 3-гидроксибутиратдегидрогеназы, Для этой цели выращивают бактериальный штамм ВЬос 1 орзецбогпопаз зр 1)егоЫез на 3-гидроксибутирате, как источник углерода, затем отделяют бактерии посредством центрифугирования, обрабатывают их и подвергают свободный от клеток белковый экстракт, имеющий начальную активность порядка 0,1 моль/мин/мг белка, воздействию протаминсульфата для осаждения и последующего удаления нуклеиновых кислот, После фракционирования посредством аммонийсульфатного осаждения соответствующая фракция отделяется, промывается, раствоз 5 С 12 й 9/04//(С 12 К 9/04, С 12 применение в клинико-химической диагностике для количественного определения кетонных тел, Цель изобретения - снижение себестоимости конечного продукта, Изобретение состоит в том, что штамм Рзеобогпопаз рмЫа АТСС 17633 выращивают на тех субстратах, при распаде которых возникают ацетоацетат или гидроксибутират, являющиеся одновременно источниками углерода. К ним относятся О, 1-лейцин, О,-лизин, О,-каротин, алифатические углеводороды с длиной цепи Сз - С 10, Культи, вирование ведут в течение 15 - 40 ч, а хроматографическую очистку фермента осуществляют на 10-карбоксидецилсефарозе.2 табл,ряется в буфере и очищается или же обогащается многократно хроматографически до активности порядка 17 моль/мин/мг белка.Способ имеет тот недостаток, что конечный продукт очень дорог, особенно если дело касается сильно обогащенной 3- гидроксибутиратдегидрогеназы, Причина не только в трудоемкости операции очистки, но и в высокой стоимости субстрата для культивирования, Недостаток состоит и в том, что активность получаемого фермента не превышает значения в 17 - 20 моль/мин/мг белка, Причина в том, что применяемый штамм Й 1)оборзеобогпопаз зр 11 егобез не в состоянии производить фермент с более высокой начальной активностью, чем вышеописанной.Наиболее близким к предлагаемому по технической сути является способ получения З-гидроксибутиратдегидрогеназы, предусматривающий выращивание штаммас 0,02 40 50 55 Рэецоовопаэ 1 егпо 9 пе на питательной среде в присутствии цитрата и сукцината в качестве субстрата при температуре 30 С и аэрации с последующим отделением клеток, приготовлении бесклеточного экстракта фракционным осаждением сульфатом аммония и хроматографическую очистку на ДЕАЕ целлюлозе и гидроксианкатите до обогащения фермента активностью 190 ммоль/мин/мг. Способ трудоемок, В 4 частях способа осуществляют в среднем 6 единичных шагов, причем необходимое проведение диализа забирает много времени. Достигнутая высокая активность на 50; обязана активированию фермента ионами М 9 , вследствие чего картина при сравнении с другими стандартными методиками изменяется.Цель изобретения - снижение себестоимости конечного продукта,Цель достигается путем выделения фермента 3-гидроксибутиратдегидрогеназы из штамма Рзецбоаопаэ рис Оа АТСС 17633, Штамм сохраняли преимущественно на бульоне с 2-нам ага ром при 4 С в темноте. Культивирование Рзеобовопаэ робка осуществляют в субмерсионной культуре на жидкой минимальной среде после пересевания из первичной культуры при 20 - 40 С (преимущественно при 30 С). Выращивание проводят на тех источниках углерода, при распаде которых образуются ацетоацетат и гидроксибутират. Такими источниками углерода являются, например, О,-лизин, О,-лейцин, О,-карнитин и т.д, и, кроме того, неразветвленные углеводороды с длиной цепи Сю - С 1 о. В качестве источников азота применяют МНаС 1, (МН 4)2 Я 04 и т.п. После выращивания в течение времени 5 - 40 ч в зависимости от физиологического состояния и количества высеваемого материала бактерии собирают, например, путем центрифугирования, промывают фосфатным буфером и в заключение превращают в бесклеточный грубый экстракт, например, путем обработки ультразвуком при близких к точке замерзания температурах с последующим центрифугированием, Находящийся в грубом экстракте фермент проявляет в зависимости от источника углерода специфические активности (табл. 1),С помощью фракционного осаждения или же экстракции солями, например, с сульфатом аммония, осуществляют 10-15- кратное обогащение фермента. Для этого целесообразным является разведение белкового экстракта с последующим осаждением подавляющего количества белка 70 -ным сульфатом аммония,5 10 15 20 25 30 35 45 Полная активность остается при этом в седименте, Для дальнейшего обогащения 3- гидроксибутиратдегидрогеназы осадок последовательно обрабатывают при 4 С растворами сульфата аммония, которые содержат 0,05 моль/л Трис, при понижающейся концентрации (МН 4)2 Я 04 и в каждом случае путем пятиминутного перемешивания. При этом фермент все больше растворяется, Основная масса фермента растворяется в районе концентраций между 35 и 20 фнасыщения раствора сульфата аммония, Фермент переосаждается путем добавления сульфата аммония до конечной концентрации в 50.На гидрофобном носителе, таком как, например, 10-карбоксидецилсефароза, возможно дальнейшее обогащение фермента. При этом на колонку, заполненную 10-карбоксисефарозой, сажается фермент в 20 насыщения раствора сульфата аммония. После промывки раствором сульфата аммония этой же концентрации производят фракционное элюирование с 17 насыщения раствора сульфата аммония. В первой фракции наблюдается 4-кратное и во второй - 7- кратное повышение специфической активности. Адсорбции способствуют сутруктуроформирующие ионы, такие как фосфат, цитрат и сульфат. Полученный согласно изобретению фермент хорошо сохраняется, При специфических активностях в 10 - 20 моль/мин/мг белка доказываются следующие максимальные чужеродные активости,;Алькогольдегидрогеназа (1 МалатдегидрогеназаЛ а ктатде гидрогеназа (0,001 В процессе выращивания бактериальной культуры выгодно работать со ступенчатым дефицитом кислорода. П р и м е р. Рэеоботопаэ рыба(Ррб 6) АТСС 17633 выращивают в субмерсионной культуре в жидкой минимальной среде, Среда содержит на литр: 6,97 К 2 НР 04, 1,5 г Ма Н 2 Р 04, 0,2 г М 9 Я 04 7 Н 20, 7,5 мг ГеЯ 04 х х 7 Н 20, 075 мг МпЯ 04 4 Н 20, 075 мг ЕпЯОа Н 20, 0,15 мг СОЯ 045 Н 20, 0,15 мг СоС 12 6 Н 20 и 0,15 мг борной кислоты,В качестве прививочных культур служат предварительные культуры, у которых к жидкой минимальной среде добавляют экстракт дрожжей (0,4 г/л) и глюкозу (10 г/л),При культивировании на О,-карнитине последний добавляют в концентрации 2 г/л1731813 55 как единственный источник углерода и азота, При культивировании на других источниках углерода (10 г/л) в качестве источника азота применяют ИН 4 С (3 г/л), После выращивания в течение 15 ч бактерии собирают центрифугированием, промывают многократно фосфатным буфером(0,067 моль/л, рН 7,5) и разрушают в заключение посредством обработки ультразвуком при 4 С, Грубый бесклеточный экстракт получают с помощью центрифугирования, разводят его 0,067 моль/л фосфатным буфером (рН 8) до достижения концентрации белка в 5-20 мг/мл,Подавляющую часть белка осаждают при 4 С из этого раствора посредством добавления сульфата аммония до 704 насыщения,Полная активность 3-гидроксибутиратдегидрогеназы находится при этом в осадке, После центрифугирования седимент суспендируют при 0 С в растворе сульфата аммония (45 насыщения в 0,05 моль/л Трис) и после этого снова центрифугируют, В седименте остается полная активность, Для дальнейшего обогащения остаток перемешивают по 5 мин при 4 С с растворами сульфата аммония, содержащие каждый 0,05 моль/л Трис-НС, рН 8 понижающихся концентрацией,Фермент растворяется при этом в возрастающей мере, преимущественно в районе концентраций между 35 и 20 насыщения сульфатом аммония (табл, 2).Фермент переосаждают снова посредством добавления сульфата аммония до конечной концентрации в 50 насыщения.После центрифугирования фермент суспендируют в 3,2 моль/л раствора аммония, рН 7, и сохраняют при 4 С, Для дальнейшего обогащения 1 мл раствора фермента в сульфате аммония 20 насыщения сажают на 2-х мл колонку с 10-карбоксисефарозой, Специфическая активность составляет 11 с( моль/мин/мг белка, общий белок - 1,5 мг, Полная активность остается на носителе, После промывания 10 мл раствора сульфата аммония (20 насыщения) на колонку подают последовательно по 2 мл раствора сульфата аммония (17;4 насыщения), В пол 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 ученных двух фракциях находится вся активность, но только 25 белка,Специфическая активность составляет вфракции 41,и моль/мин/мг белка (0,3 мг белка) и вофракции - 80,и моль/мин/мг белка (0,1 мг белка),Суспензии фермента сохраняют в насыщенном растворе сульфата аммония. После 6 мес сохранения при 4 С потеря активности 3-гидроксибутиратдегидрогеназы не наблюдалась.Специфическая активность 3-гидроксибутиратдегидрогеазы в грубых экстрактах из Рзеобощопаз ритба полсе роста на ацетоацетатобразующих субстратах для культивирования приведена в табл.1Результаты очистки 3-гидроксибутиратдегидрогеназы (субстрат для культивирования О, -карнитин) из Рзеитопаз рцсЫа АТСС 17633 приведены в табл.2. Получение проводили из 17 мл грубого экстракта (7,5 мг/мл белка).Формула изобретения Способ получения 3-гидроксибутиратдегидрогеназы, предусматривающий культивирование продуцирующего микроорганизма рода Рзецботопаз на питательной среде, содержащий источники углерода, азота, минеральные соли - сернокислый магний, фосфорнокислый одно- замещенный калий, фосфорнокислый двузамещенный натрий, соединения железа и хлора и воду при оптимальной температуре и аэрации с последующим отделением клеток, приготовлением бесклеточного экстракта и перевода его в белковый экстракт фракционным осаждением сульфатом аммония и хроматографическую очистку, о тл и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью снижения себестоимости конечного продукта, в качестве продуцентра используют штамм Рзецбовопаз росса АТСС 17633, а в качестве источника углерода - О,-лейцин, О, : лизин, О,-карнитин, алифатические углеводороды с длиной цепи Сб - С 1 о, процесс культивирования ведут в течение 15 - 40 ч, причем хроматографическую очистку фермента осуществляют на 10-карбоксидецилсефа розе,1731813 Таблица 1 Таблица 2 П р и м е ч а н и е, О - осадок; Н - надосадочная жидкость,10 15 Составитель И,ПриваловаТехред М.Моргентал Корректор М,Пожо Редактор О.Хрипта Заказ 1557 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина, 101