Способ обнаружения присутствия вируса иммунодефицита человека или другого вируса, дающего аналогичную клиническую картину

(515 6 01 М 3 ОСУДАРСТВЕННЬПО ИЗОБРЕТЕНИПРИ ГКНТ СССР КОМИТЕТИ ОТКРЫТИ ИЗО ЕТЕ АТЕН 13 395. УТСТ- ЛОЕГО РТИвирусологии,жения вируса ие относит способу об(54) СПОСОБВИЯ ВИРУСВЕКА ИЛИАНАЛОГИЧННУ,29 (088.8)а, Яс 3 епсе, 1986, 234, 1392 ОБНАРУЖЕНИЯ ПРИСА ИММУНОДЕФИЦИТА ЧДРУГОГО ВИРУСА, ДАЮЩУЮ КЛИНИЧЕСКУЮ КА Изобретение относится к области вирусологии, в частности к способу обнаружения вируса иммунодефицита человека или другого вируса, дающего аналогичную клиническую картину.Открыто ингибирующее вещество, выделяющееся или понуждаемое к выделению клетками, инфицированными вирусами иммунодефицита человека. Этот ингибитор, видимо, физически связан с ферментом РН- азой- конечным продуктом в системе 2, 5-олигоаденилят-РН-аза , и приводит к выходу из строя всей иммунной системы, что позволяет вирусам бесконтрольно мультиплицироваться. Описаны методики идентификации таких ингибиторов либо непосредственно, либо косвенно по отсутствию РН-азы . или неактивности РН-азы 1., либо по присутствию промежуточных биохимических веществ в системе 2-5 А-РН-аза иммунодефицита человека или другого вируса, дающего аналогичную клиническую картину, У больных с синдромом заболевания лимфатических узлов (СЗЛ), родственным СПИДУ комплексом (РСК) и синдромом приобретенного иммунодефицита (СПИД), выделены и идентифицированы индуцируемые НЧ ингибиторы РН-азы 1 У таких пациентов функциональные 2 - 5 А не способны активировать РН-азув моноядерных клетках периферийной крови, эндогенная дзРНК, в особенности неспаренная дэРНК, активирует 2-5 А-синтетаэу, что приводит к увеличению концентрации эндогенных 2 - 5 А. Установлено, что наличие ингибитора РНК-азы является маркером присутствия СПИД, СЗЛ или РСК, 1 табл.., при этом ингибитор служит маркером для обнаружения присутствия НИ или родственных вирусов, дающих по существу аналогичную клиническую картину,Обсуждается также прогнозирующее значение такого маркера с точки зрения развития СПИДа в полном расцвете у больных, в частности у больных, имеющих антитела к НЧ в периферийной крови и тканях;в том числе крови, фракциях крови, клетках:трансплантированных органов и клеточных экстрактах, Описаны способы активации РН-азы . или дезактивации ингибирующего РН-азувещества, Частью предлагаемого изобретения являются лечебные методы борьбы со СПИДом и родственными вирусами и контроля развития таких вирусов путем активации РН-азыи/или удаления, или дезактивации ингибирующего РН-азувещества (веществ),или направленного на ин 1687035гибиторы вируса. В предлагаемое изобретение включены способы получения антител к указанным вирусам как и Ио, так и и чтго, использованием в качестве антигена специфичного ингибитора РН-азыили направляемых вирусом ингибиторов биохимических промежуточных веществ в системе 2 -5 А -РН- аза .В экстрактах моноядерных клеток периферийной крови(МКПК) людей с синдромом заболевания лимфатических узлов (СЗЛ), родственным СПИДУ комплексом (РСК) и синдромом приобретенного иммунодефицита (СПИД), замерены компоненты системы 2-5 А-синтетаза-РН-аэа ., Уровень 2-5 А-синтетазы в высшей степени завышен у больных СПИДом и находится на баэальном уровне у больных РСКом или СЗЛом. Однако, вне зависимости от колебаний концентрации 2-5 А-синтетаэы (2-5 А) высокие эндогенные концентрации 2-5 А (до 35 нМ) обнаружены у больных СЗЛом, РСКом и СПИДом, Зкстракты 2-5 А на деле оказались функциональными, о чем свидетельствуют испытания на связывание, расщепление рибосомной РНК и испытание с ядро-целлюлозой, Несмотря на повышенные концентрации эндогенной функциональной 2-5 А, ни для одного из больных СЗЛом, РСКом или СПИДол не могла быть показана активированная РН-аэаОднако у всех здоровых людей РН-аза . в МКПК была активирована, даже несмотря на то, что концентрации эндогенной 2-5 А составляли менее 5 нМ. Опыты со смешиванием свидетсльствуют о присутствии ингибитора РН- азы 1. у пяти больных СЗЛол, РСКом и СПИДом, Такой ингибитор может переноситься и может препятствовать индуцируемому 2 - 5 А специфичному для рН-азыразрушению рРНК в экстрактах клеток.929, Один из таких ингибиторов РН-аэыосаждается трихлоруксусной кислотой (ТХК) и этанолом, Ингибирование действия РН- азыснимается обработксй РН-азой А или протеазой. Исследования предполагают,что в МКПК больных СЗЛом, РСКом или СПИДом эндогенная дзРНК активирует 25 А-синтетаэу, что приводит к увеличению концентрации эндогенных 2-5 А. Способности функциональных 2-5 А активировать РНазыв МКПК больных СЗЛом, РСКом иСПИДом,Определение концентрации 2-5 А и функционирования РН-аэыв экстрактах МКПК с использованием специфичных и чувствительных определений показывает то, что дефект противовирусной системы 2- 5 А-синтетаза-РН-аза . в МКПК больных СЗЛом, РСКом и СПИДом заключается в 5 10 15 20 25 30 35 40 присутствии ингибитора РН-азы , но не в синтезе нефункциональных 2-5 А. Приводимые здесь данные подчеркивают, что кажущиеся парадоксальными взаимодействия, происходящие в инфицированной вирусом клетке, могут быть теперь объяснены рациональными согласованными биохимическими понятиями.Связанную с акриловыми шариками (1 мг) РН-аэу А или связанную с карбоксиметилцеллюлозой (1 мг) (3 цгпа саетса Со) вымачивают в МР 40 лиэисном буфере (16), (10 мкл) 2 ч при 30 С, после чего смешивают с экстрактом МКПК (100 мкг на испытание) до окончательного объема 15 мкл и дополнительно инкубируют 2 ч при 30 С. Во время повторного инкубирования содержимое пробирок осторожно несколько раз перемешивают. Контрольные образцы инкубируют без всякого добавления фермента, Иммобилиэованные ферменты осаждают центрифугированием (10000 х 9, 5 мин, комнатная температура). Пять микролитров центрифугированных фракций добавляют к экстрактам клеток929(150 мкг белка на испытание) и проводят испытания по расщеплению рРНК для определения специфичной для РН-азы . активности.Выделенные иэ экстрактов МКПК эндогенные 2-5 А данные характеризуют проведением испытаний по расцеплению рРНК, Образованные при расщеплении РН-азой . продукты с выделенными из МКПК 2-5 А значительно отличаются в экстрактах клеток929 от продуктов, полученных с аутентичными 2-5 А, Например, эндогенные 2-5 А, выделенные из МКПК, активируют РН-аэуиз клеток929 с расщеплением 283 и 188 рРНК и образованием трех специфичных продуктов расщепления. Объяснение наблюдаемых различий в продуктах расщепления может заключаться в том, что эндогенные 2-5 А, синтеэируемые в МКПК, отличаются от аутентичных 2-5 А.Для выявления уровня свободной (не- 5 А-активированной) РН-азы , являющейся целевым ферментом для 2-5 А, использовано испытание с радиосвязыванием. Могут быть также использованы и другие целевые ферменты. В экстрактах МКПК больных СЗЛом, РСКом и СПИДом уровень свободной РН- азыв 5-7 раз выше, чемуэдоровыхлюдей. Однако испытание на радиосвязывание имеет ограниченное значение для образцов, в котрых эндагенные 2-5 А конкурируют с рзА 4/ Р/рСр эа связывание с РН-азойСоответственно, результаты испытаний по радиосвязыванию точно не отражают уровень РН-аэыТаким образом, существенно определение уровня 2-5 А-активиро-.5 10 20 25 30 35 40 45 50 55 ванной РН-азы , Для достижения этого использован новый чувствительный метод, позволяющий определять активированную РН-азу 1. в экстрактах М КПК, выделенных всего лишь из одного миллилитра периферийной крови, и этот метод основан на специФичности расщепления 2-5 А-активированной РН- азы на рРНК.Вследствие того, что рРНК присутствует в МКПК ниже уровня детектирования, экстракты клеток Н. 929 (субклон штамма клеток929 с дефицитом РН-азы 1) используют в качестве источника рРНК. Использованием этого метода удалось показать, что РН-аза Е неактивна в экстрактах МКПК больных СЗЛом, РСКом и СПИДом, где имеет место высокое внутриклеточное аккумулирование функциональных 2-5 А, Экстракты МКПК от всех здоровых людей, подвергшихся испытанию, показали присутствие активной РН-азы , дающей специфичные продукты расщепления несмотря на то, что 2-5 А присутствует в концентрации5 нМ.В экстрактах МКПК, инфицированных СЗЛом, РСКом и СПИДом больных, присутствуют биологически активные 2-5 А. Почему же неактивна РН-аза , Для определения того, является ли отсутствие активности РН- азыследствием нефункциональности РН- азы 1 или следствием присутствия ингибитора активности РН-азы , проведены следующие опыты со смешиванием. Экстракты клеток929, содержащие функциональную РН-азу, смешивают и совместно инкубируют с экстрактами МКПК больных СЗЛом, РСКом и СПИДом, Специфичных продуктов расщепления для РН-азы . не обнаружено,Эндогенные 2-5 А, ответственные за активацию РН-азы Е, дают по меньшей мере четырехкратное разбавление относительно клеточных экстрактов, из которых эти образцы происходят. Эти данные указывают на присутствие нерастворимого в ТХК ингибитора (ингибиторов) РН-азыв МКПК больных СЗЛом, РСКом и СПИДом, Такойингибитор не обнаружен у здоровых людей, поскольку их экстракты МКПК генерируют специфичные для РН-азыпродукты расщепления после совместного инкубирования с экстрактами клеток929, Точно так же растворимая фракция ТХК МКПК от здорового человека генерирует специфичные продукты распада, Присутствие функциональных 2-5 А и тат факт, что предполагаемый ингибитор РН-азы . осаждается ТХКи этанолом, наводит на мысль атом, что ингибитор РН-азыне является аналогом 2-5 А, как недавно идентифицировалась в клеточных культурах, инфицированных НЯЧи ретровирусом.Опыты с использованием разрушающих ферментов, иммобилизаванных на твердых носителях, дают совершенно новое представление о природе ингибитора (ингибиторов) РН-азы , найденных в экстрактах МКПК больных СЗЛом, РСКом и СПИДом. Если экстракты МКПК больных СПИДом предварительно инкубируют с иммобизированной протеазой или РН-азой А и затем совместно инкубируют с экстрактами клеток929, активность РН-азы . восстанавливается, о чем свидетельствует появление специфичных продуктов расщепления,Настоящие исследования показывают, что дефект в противовирусной системе 2-5 А- син тета за-Р Н-аза . в М КП К 6 аль н ых СЗЛом, РСКом и СПИДом может быть отнесен за счет ингибитора РН-азы , а нее засчет отсутствия функциональных 2-5 А. Ингибитор РН-азыприсутствует в экстрактах МКПК больных СЗЛом, РСКом и СПИДом, что указывает на воэможность существования ингибитора на всех стадиях развития типичных ретровирусных заболеваний и что этот ингибитор также имеет отношение к различным субострым (хроническим вирусным) патогенным инфекциям, С учетом того, что во всех случаях МКПК больных СЗЛом,РСКам или СПИДом, подвергшихся испытанию, соде ржат Р Н К Н И (определено молекулярной гибридизацией) и центры инфицирования НМ (определено совместным культивированием лимфоцитов), вполне вероятно, что ингибитор РН-азы 1 индуцируется вирусом.Репликация вируса модифицирует систему 2-5 А-синтетаза-РН-азатаким образом, что естественное противовирусное состояние не может быть в полной мере экспрессировано или отрегулировано, Вполне вероятно, что белок (и), и РНК (ы), закодированные НИ или другим сосуществующим с ним ретровирусом, могут ингибировать активацию РН-азыП р и м е р. Моноядерные клетки периферийной крови (МКПК) выделяют на Есо 1- Нурадие, клетки929 и Н 929(субклон929с дефицитом РН-азы 1.) получают в культуре с манаслаем, цитаплазматические экстракты клеток Е 929 и НЕ 929 получают в глицериновом буфере, экстракты МКПК получают в ЙР 40 лизиснам буфере согласно известным методикам,Концентрация белка в экстрактах 1- 15 мкг/мкл,Активность 2-5 А-синтетазы определяют в выделенных экстрактах МКПК (50 мкг ча испытание) использованием пали (1)-па 168703515 20 25 30 35 40 ли(С)-агарозы. 2-5 А выделяют из растворимых в ТХК фракций экстрактов МКПК после нейтрализации фреоном-три-н-актиламином. Экстрагированные ТХК 2-5 А затем лиофилизуют и вновь растворяют в воде таким образом, что все образцы стандартизированы в обьеме воды до эквивалента в 5 мкг белка на 1 мкл. Концентрации 2-5 А, присутствующие в экстрактах МКПК, измеряют в испытании на радиосвязьвание с экстрактами клеток 1.929 в качестве источника РНазы 1. Из 18900 срой рзАл/ 2 Р/рСр (удельная активность 3000 С 1/ммоль, АаегзЬагп), добавленных на одно испытание, 19400 с 1 ргп связываются. и РН-азой в отсутствие 2-5 А. Примерно 9-14 рзА 4/ /Р/рСр замещается в испытаниях, в которых добавляют 5 мкл выделенных обраэцов 2 - 5 А. Концентрацию,2-5 А в МКПК определяют сравнением с калибровочной кривой для аутентичных 2-5 А, это определение основано на подсчете концентрации цитоплазмического белка в 25 мкг/мл, Концентрацию 2-5 А, выделенных из МКПК, также измеряют в испытании с адроцеллюлозой с клетками .929 в качестве источника РН-азы. Активация РН-азыв таком испытании основана на превращении поли (О)/ Р/рСр в растворимые в кислоте фрагменты. Пзоимерно 5-20% всего количества поли(0)/ Р/рСр(15000 бргп) расщепляется в присутствии 2,5 мкл выделенных образцов 2-5 А. Концентрации определяют по калибровочным кривым для аутеничных 2-5 А. Уровень свободной РН-азыизмеряют при испытании на радиосвязывание после добавления 20000 бргп рз/А 4/ Р/рСр к экстрактам МКПК (50 мкг белка на испытание).Активность 2-5 А-синтетазы, концентрация эндогенных 2-5 А, уровень свободной РН-азы 1. и присутствие ингибитора РН-азы 1 в экстрактах МКПК больных СЗЛ 1 ом, РСКом и СПИДом приведены в таблице.Активность индуцированного интерфероном фермента (2-5 А-синтетазы) в экстрактах МКПК, полученных от больных СЗЛом, РСКом и СПИДом, измеряют 1 п ч 1 го и сравнивают с активностью экстрактов от здоровых людей (таблица). Концентрации 2-5 А-синтетазы у больных СПИДом ( 3 и 5) были в 16 и 20 раз выше, чем у нормальных пациентов (таблица). И напротив, концентрации 2-5 А-синтетазы у больных СЗЛом (4),РСКом (Ж) и СПИДом с саркомой Капоши (СК) (В 4) выше всего лишь в 1,3 - 5 раз, что подтверждают сделанные другими основные наблюдения.Для определения того, являются ли такие измеренияи ч 11 го 2-5 А-синтетазы указанием на функциональность фермента 1 п ч 1 чо, из МКПК экстрагируют 2-5 А, Биологическую активность 2-5 А из растворимых в ТХК фракций экстрактов М КП К усиленно характеризуют в испытаниях на радиосвязывание и испытаниях с ядро-целлюлозой. Концентрации 2-5 А аналогичны при испытании двумя методами (таблица). Сходность результатов, полученных методами А и В (таблица), указывает на то, что 2 - 5 А, выделенные из экстрактов МКПК человека, могут связываться и активизировать РН-азуиз клеток 1929 в той же степени, что и аутентичные 2-5 А,Видимое отсутствие количественной корреляции между уровнями 2 - 5 А-синтетазы и эндогенными 2-5 А при СЗЛ, РСК и СПИД (таблица) может быть впервые объяснено следующим образом. Определение 2- 5 А-синтетазы в сая п ч 11 го основано на частичной очистке через поли (г 1)-поли(гС)-агарозу, соответственно, в таком испытании измеряют только свободную 2-5 А-синтетазу, а не 2-5 А-синтетазу, активированную 1 п ч 1 чо с помощью дзРН К, Однако, непосредственно измеряют эндогенную 2- 5 А-синтетазу плюс деградируемые 2-5 А- ферменты (например, 2-фосфодиэстераза и фосфатазы). Таким образом, аккумулирование 2-5 А МКПК больных СЗЛом, РСКом и СПИДом указывает на низкую активность деградируемых 2-5 А-ферментов. Присутствие 2-5 А в МКПК также указывает на то, что существует эндогенная дзРНК, до сего времени не обнаруживаемая как у здоровых людей, так и у больных СПИДом,Формула изобретения Способ обнаружения присутствия вируса иммунодефицита человека или другого вируса, дающего аналогичную клиническую картину, включающий определение присутствия биологического маркера в пробе биологического материала, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что в качестве маркера используют инГИбИТОР РНК-азы, а в качестве биологического материала используют моноядерные клетки периферической крови,1687035 10 280 270 270 260 18 25 Ингибирова И 95 50 57 10 Неингибирована С 9 Хпо иосвязь ча ни отклонениев испытании Радовано);в испытании с ядро-целло), стандартное отклоненв испытании по радиосвязьо), стандартное отклоненв испытании по расщеплендля 7 контрольных обраэцо а - стандартноеб - определенонию (дублирв - оп и м ределено ублир она редел ено ялось,Составитель И.ТарееваТехред М,Моргентал Коррек едактор Л,Грати М.Пож каз 8 ВНИ Тираж ПодписноеГосударственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СС 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент",г. Ужгород, ул, Гагарина, 10 Ю 2 РСКЮЗ спиДЮ 4 СПИД+СКЮ 5 спиННОРМА- не определ НО 31 35 15 25 НО 16 юлозой ие .1 Х; званию ие (103; ию рРНК; в (дубли