5 -фосфонаты 3 -азидо-2, 3 -дидезоксинуклеозидов, являющиеся специфическими ингибиторами вируса спид в культуре лимфоцитов человека н9шв

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 19 (1 А 1 ОСУДАРСТВЕННЫО ИЗОБРЕТЕНИЯРИ ГКНТ СССР КОМИТЕТОТКРЫТИЯМ РЕТЕНИ 2СФОНАТЫ 3-АЗКЛЕОЗИДОВ, ЯВЛЯИНГ 11 БИТОРАМИЛИМФОЦИТОВ ЧЕетение касает5 -фосфонатовсинуклеозидов(54) 5-ФО ДЕЗО КСИНУ ФИЧЕС КИМИ В КУЛЬТУР (57) Изоб частности 3 -дидезо ДО-3 -ДИЮРИЕСЯ СПЕЦИИРУСА СПИД ЛОВЕКА Н 9/ШВ я сахаров, в 73 -азндообщей ф-лы(71) Институт мАН СССР Инстит иоло гни и Все-. учный ова,ов,.М. БСгаСеду 1)Б.07,фосфонат Зфлеозидов (11 азидо 1) форму к сину бр нои биолои касает5 -фосфонзоксинукл3 -азидо(1) 51дидезокс ПИСАНИЕ ИЗО АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛ Бюл. Р 9олекулярнойут вирусолоим. Д.И. Ивановского АМН Ссоюзный кардиологический нцентр АМН СССР(56) МЫзиуа Н., Вгойег Б.Гог апИчгиз Сегору п А 1БаСиге, 1987, ч. 325, Р 61р. 773-778. тение относится к молекуляр"гии, вирусологии и медицинея группы новых соединенийатов Зф-азидо,3 -диде 2 2еозидов: 5-метилеифосфонат2,3-дидезоксинуклеозидовидрофосфонат 3-азидо,3 нуклеозидов (11), 5-метил 51)5 С 07 Н 19/073, А 61 К 31/70 где 1 - 1 а) - СН-Р(0)(ОН)а, 11 а-(г ) - РН(О)ОН, 111 а) - Р(0)(СН )ОН. В )тимин-ил; б) цитозин-ил; в) аденин-ил; г) гуанил-ил; являющихсяспецифическими ингибиторами вирусаСПИД в культуре лимфоцитов человекаН 9/ШВ, что может быть использованов вирусологии и медицине. Цель - создание новых активных и малотоксичныхвеществ указанного класса. Синтез ведут восстановлением, например 3 -ази 7до,3 -дидезокситиамидина с по) )мощью диметилформамидной суспензиигидрида натрия с последующим добавлением диэтилоксиметиленфосфоната, Выход целевых веществ 40-807. Новые вещества менее токсичны, чем известныеаналоги. 2 ил., 3 табл.1548182 10 5 где 1 а, Й- -СН )- Р-ОИОН 011 а-г ) Р, -- Р - ОИН0Р, - -Р-ОНсн,) тимин-ил; б) цитозин- и"1в) аденин-ил; г) гуанин-ил которые избирательчо подавляют репро дукцию вируса СПИД в культуре лимфоцитов человека Н 9/ШВ.Целью изобретения является снижение токсичности избирательных ингибиторов репродукции вируса СПИД 25 в культуре клеток лимфоцитов человека, которая достигается применением в качестве веществ, блокирующих размножение вируса СПИД, соединений Формулы (1-111).30П р и м е р 1. Синтез 5-метилен) )фосфоната 3-азидо,3 -дидезокситимидина (1 а).К суспензии гидрида натрия (54 мг, 2,25 моль) в 3 мл диметилформамида в течение 15-20 мин в атмосфере инерт ного газа добавляют раствор 3 -ази 1 до.,3 -дидезокситимидина (АБТ)(200 мг, 0,75 моль) в 5 мл диметилформамида, перемешивают 30 мин при 40 20 С. Затем добавляют раствор толуоолсульфоната диэтилоксиметиленфосфоната (240 мг, 0,75 моль) в 3 мл диметилформамида и интенсивно перемешивают 3 сут при 20 С. Ход реакцииоконтролируют по ТСХ в системе В. По окончании реакции добавляют 0,13 мп уксусной кислоты, реакционную массу упаривают, переупаривают с 5 мл ди" метилформамида. Остаток экстрагируют хлороформом (5 ф 5 мл). Экстракты упаривают, остаток очищают на колонке с силикагелем 40/100 (122,5 см). Элюцию проводят 300 мл хлороформа, затем 400 мп смеси хлороформ-этанол (9:1), собирая фракции по 2 мпСоот 55 ветствующие Фракции собирают и упари-вают. Получают в виде масла 130 мг вещества с Р 0,63 (В), которое растворяют в 3 мл диметилформамида, добавляют триметилсилилбромид (О 3 мл).о)при 4 С, перемешивают 30 мин и выдержива)от еще 24 ч при 20 С. Реакционную массу упаривают, добавляют5 мл воды и триэтиламин до рН 9, выдерживают 1 ч и экстрагируют хлоро-формом (35 мл). Водный слой упаривают, остаток очищают на колонке сцеллюлозой ДЕв НСО -Форме объеэмом 300 мл в линейном градиенте бикарбоната аммония от 0 до О,ЗМ, общий объем элюента 3 л. Фракции, содержащие соединение 1 а), упаривают, переупаривают с водой (5 ф 10 мл)и этанолом (3 20 мл).Остаток экстрагируют 10 мл метанола, упарива)от до 2 мл, добавляют30 мг БаС 10 и 5 мл ацетона. Осадокотделяют, промывают ацетоном, сушат.Получают белое аморфное вещество, вы,ход 82 мг, 407., В 0,2 (А).Уф-спектр: Э о 265 нм (Е 9600,рн 1).Н-ЯМР-спектрДО,3 ), м.д.:1,95 д (ЗН, СН , Ю СН Нб д 0,5 Гц)12,60 м (2 Н, Н 2),); 3,69 д (2 Н, СНР,Ю СНР = 8,6 Гц); 3,70-4,80 м (ЗЙ,Н 4) + 2 Н 5); 6,18 м (1 Н, Н 1)У Н 1,Н 2 = 6 Гц); 7,54 д (1 Н, Нб, Х == 0,5 Гц),П р и м е р 2, Синтез гидрофосфоната 3 -азидо,3 -дидезокситимиди )на (11 а).Растворяют имидазол (0,50 г,7,36 моль) в 15 мл. абс. ацетонитриола и охлаждают до 0 С, При перемешивании добавляют треххлористый фосфор(0,19 мл, 2,17 моль) и затем триэтиламин (1,05 мл, 7,54 моль). Реакционную смесь перемешивают 15 мин при0 С, затем в течение 30 мин добавляютопо каплям раствор 3 -азидо,3 -диде-) )зокситимидина 135 мг (0,5 моль) в10 мл ацетонитрила так, чтобы температура реакционной массы не поднималась выше +5 С.оРеакционную масу перемешивают 2 чпри 20 С, добавляют 3,5 мл и черезо30 мин упаривают. Удаление ацильныхзащит с аминогрупп гетероциклов проводят насыщенным раствором аммиакав метаноле при 20 оС в течение 24 ч.Затем вещество наносят на колонку стоеперлом (525 см) и элюируют бикарбонатом аммония в линейном градиентеконцентраций от 0 до 0,3 М; общийобъем 1 л. Соответствующие Фракции8260-0,5 М затем 0,5 М БН НСО в 30%спирте элюируют 116, упаривают досуха, остаток очищают еще раз на колонке (30 ф 2,0 см) с ДЕАЕ-целлвпозой(НСО.), элюируя градиентом концентрации БН,НСО ( О -э О, 3 М) .фракции с веществом упаривают, переупаривают с водой и высушивают отгонкой абс. спирта. Выход 97 мг, 32%,константы как в примере 3,П р и м е р 5. Синтез 5-гидрофосфоната 3 -азидо,3 -дидезокснадет )козина (11 в), метод А.Синтез 11 в проводят, исходя из190 мг (0,5 моль) 3 -азидо,3 -дидеэокси-Бб-бенэоиладенозина по методу,как в примере 2.Выход 11 в 116 мг, 66%, Б = 0,18,= 0,14, Уф (вода), Ъ ,щ,с 250, 270 нм,ВЭЖХ, время удерживания 8,4 мин, условия примера 2. 25 15481собирают и упаривают. Избыток солиудаляют многократным переупариваниемс водой. Остаток лиофилизуют нз воды.Выход 11 а 140 мг, 80% в расчетена аммонийную соль. Б (А): 0,25(11 а).Уф-спектр ( вода ) Ъс 269 нм.Время удерживания на колонке Ицс 1 еовП 120-7 БН в линейном градиенте КНРО от 0,05 до 1 М 7,2 мин,скорость потока 1 мл/мин,Р-ЯМР-спектр (Д 0,3), м.д6,5 д (1 Н, Н, Тя = 629 Гцт рцэр == 6,3 Гц, ,УР,но -- 1,5 Гц).Н-ЯМР-спектр(Л О, 3 ), м.д.:7,66 д (1 Н, Н 5, Т,э н = 8,0 Гц);5,79 д (1 Н, Нб, Тя= 8,0 Гц)1,5,95 т (1 Н, Н 1 Тг= 6,0 Гц);4,21-3,89 м (2 Н, НЗ+ Н 4 ); 3,843,80 м (2 Н, Н 5); 2,91-2,14 м (2 Н,Н 2).П р и м е р 4. Синтез-гидрофосфоната 3-азидо3-дидезоксицити"ф, 45дина (116), метод Б,К раствору 252 мг (моль) 3-азидо 2 ,3 -дидезоксицитидина (АгС). в1 О мл абс. пириднна добавляют1,4 моль. трибутиламмониевой солифосфористой кислоты в 5 мл пнридннаи далее 290 мг (1,4 моль) Б,Б-дициклогексилкарбоднимида (ДЦК). Через3 сут к реакционной смеси добавляют20 мл воды, перемешивают 1 ч,. Упаря"вают досуха, остаток растворяюай в200 мл воды,наносят на колонку с20 мл Даукса 18 (НСО,), промываютв градиенте концентрации БННСО 1 Р-ЯМР-спектр (Д О 8 м.д.):Ръ.ф ф 6,45 д (1 Н, Н, Тн,Р = 630 Гц, ТН-ЯМР-спектр (Д О 0 ) д7,91 с (1 Н, Н 8 ; 6,85 т (1 Н, Н 1 ), Юну,щ= 7,0 Гц); 4,85-4,00 м (4 н,НЗ+Й 4+2 Н 5 ) 2,02-2,61 м (2 Н, Н 2 ).П р и м е р 8, Синтез 5-гидрофосфоната 3 -азидо, 3 -дндезоксигуаноэина (11 г), метод БСинтез (11 г) проводят, исходя из292 мг (1 моль) 3 -азидо,3-дидезоксигуанозина (АкО), как в примере4, Быход 98 мг, 267, константы какв примере 7,П р и м е р 9. Синтез 5 -метилфосфоната 3 -аэидо,3 -дидезоксити 3)мидина,(111 а).К раствору 3 -азидо,3-дидезокситимидина (130 мг, 0,5 моль) в 2 млтриметилфосфата при 0-4 С прибавляютов течение 3 ч дихлорметанфосфонат(200 мг, 1, 5 моль), перемешиваютночь при 4 С и 5 ч при ИО С. Реакционную массу упаривают, к остатку добавляют при охлаждении до 0 С 5 мл вооды и 1 мл триэтиламина, выдерживают1 ч и вновь.упаривают, Остаток очищают хроматографией на колонке(20 4 см)с целлюлозой ДЕв НСО - форме. Элю 3цию проводят 3 л линейного градиента 25бикарбоната аммония от 0 до. 0,1 М,Соответствующие фракции упаривают,Избыток соли удаляют многократнымпереупариванием с водой. Остаток экст.рагируют 10 мл метанола, концентрируют до 2 мл, добавляют 30 мг ИаС 104и 5 мп ацетона. Осадок. отделяют, промывают ацетоном, сушат. Выход 120 мг,337., считая на натриевую соль. Белое .,аморфное вещество. 35К 0,6 (А), УФ-спектр.Зад 265 нм(Н Н 1 Хню= 6,0 Гц); 760 д (1 Н,Спектры ЯМР новых соединений регистрируют в ДО на спектрометре7 агхап ХЬ - 100-15. В качестве внутреннего стандарта используют триметилфосфат в случае Р-ЯМР-спектровэи тетраметилсилан в случае Н-ЯМР 50спектров. Спектры УФ регистрируют наспектрофотометре Яресогй УЧ-увМ( ГДР). ТСХ проводят на силуфолев системах изопропанол.-ный водный аммиак-вода 7:1:2 (А) и хлороформ-этанол 9:1 (В).П р и м е р 10. Изучение свойствсоединений 1-111 ингибировать репродукцию вируса СПИД. В качестве источника вируса СПИД использовали перевиваемую лимфобластопдцую линию клеток человека - продуцентов вируса СПИД - 19/ЦВ. Культура клеток была получена от д-ра Б. Галло, Национальный институт рака, США, Продукция вируса клетками контролировалась в реакции непрямой иммунофлюоресценции, электронно-микроскопически и в реакции иммуноблот. Клетки культивировали в среде КРМ 1640 с 157,-ной инактивированной сывороткой эмбриона коров, с 300 мкг/мл глутамина, 100 мкг/мл гентамицина, 1 О мМ НЕРЕ-буфера и выращивали в виде суспензии. Культуральную жидкость, содержащую вирус, центрифугировали при 5000 об/мин в течение 10 мин и использовали для инфицирования культуры неинфинированных клеток Н 9 из расчета 1 мл. суперцатанта культивируемой жидкости содержащего приблизительно 10 вирусных частиц в61 мл намл клеточной суспензии, содержащей 1 О клеток,.Инфицирование клетки Н 9 культивировали в среде КРМ 1640 с 157 инактивированной сывороткой эмбриона коров, 300 мкг/мл глутамина, 100 мкг/мл гентамицина, 100 мМ НЕРЕ Я-буфера и инкубировали при 37 С в увлажненной атмосфере 57. СО. Все изучаемые соединения добавлялись в среду непосредственно после ицфициро 1 вания клеток вирусом. Учет результатов проводят через пять-шесть суток после инфицирования клеток. Реакцию не рямой иммунофлуоресцецции проводили в фиксированных препаратах антиген-содержащих клеток - продуцентов вируса СПИД. Подсчеты жизнеспособных клеток осуществляли с использованием красителя трипанового синего в гемоцитометрической камере Горяева.Ряд опытов, в частности с АкТ проводили в аналогичных условиях с использованием культуры лимфоцитов периферической крови здоровых доноров, выделяемых в градиенте фиколла-изонака. За ,8 ч до инфицирования клеток в среду добавляли Фитогемаггютиниц концентрации 10 мкг/мл, а после инфицирования вносили в среду 107.-ный раствор природного интерлейкцна.1На фиг,1 и 2 и в абл,1, 2 приведены данные по изучеццю подавления вируса СПИД в клетках с помощью АкТ, 1548182АкС, АкА и Ахб (как контроля) и Фосфонатов 1-111. Как видно из этих данных, например АкТингнбирует репродукцию вируса СПИД, начиная с концентра 5ции 1 мкр 1, хотя при этой концентрацииобщее количество выросших составляетлишь 50% от контроля, Подавление роста клеток вызвано главным образомцитотоксическим эффектом вируса ( ана- Ологично, как в контроле клеток с вирусам). Далее при более высоких каицентрациях АкТ начинает оказыватьгоксическое действие, так как количество клеток уменьшается по мере повышения концентрации АкТ (0,58 10клеток/мл при 5 мкМ и 0,35 10 клебток/мп при 10 мк 14). В то же время вслучае новых соединений, например 1 аи 11 а, количество выросших клеток 20резко увеличивается по сравнению сусловиями при низших концентрациях.1 а и 11 а (с 0,7510 до 1 10 кл/млдля 1 а и с 0,65 10 до 1,0 1 О кл/млб бдля 11 а). 25При этом содержание инфицированных вирусом клеток для 1 а и 11 а сохраняется на уровне фонов (1 ОЕ),Данные экспериментов показывают,что все 5-фосфонаты 3 -азидо,3 - 30дидезоксинуклеозидов эффективно подавляют репродукцию вируса СПИД вкультуре лимфоцитов человека,П р и м е р 11. Определение токсичности веществ на клетках Н 9/ШВи МТ 4 (табл.3). К пробам суспензий по 1 мл клеток около 1 млн , растущих на среде как в примере О после окончаУ р40 ,ния одной генерации размножения (около 18 ч) прибавляют 1-2 мкКюри 1 Н тимидина, уд. активность 22-26 Кюри/1 ммоль и затем ингибитор до концентра. ций 1, 10, 30, 100, 300 мкИ имИ, Растворы инкубируют половину перио)да генерации (около. 9 ч) и клетки оз"мывают центрифугрованием ( 1,5 тюс,оборотов в 1 мпн, О мин), промываютсредой еше 2-3 раза с подобным центрифугированием, обрабатывают тритоном Х 100 ( прибавляя его до концентрации 5 Е), наносят на фильтры ОК/С,фильтры промывают 5 Б-ной трихлоруксусной кислотой, Включение радиоактивного материала в контроле около 60 тыс. имп/мин, фоновое включение 500-600 имп,/мин,Таким образом, соединения формулы1-111 ингибируют размножение вирусаСПИД в культуре лимфоцитов человекаи проявляют меньшую токсичность посравнению с известными структурнымианалогами (фиг,1 и 2 и табл.1-3).Формула изобретения5- Фосфонаты 3 -азидо,3 -дидезоксинуклеозидов обшей Формулывон3Огде 1 а) В - -СН 2 - Р-ОНОНО111 - ) Ф- -Р-ОННО11П 1 а) . Ц Р ОН1сн,В - а) тимин-ил; б) цитозин-ил;в) аденин-ил; г) гуанин-ил, являющиеся специфическими ингибиторами вируса СПИД в культуре лимфоцитов человека Н 9/ПВ.1548182 12 Таблица 1 АхТ Условия опыта Ха Па П 1 а Клетки, содержащие вирус Концентрация клеток, 1 О мл Клетки,содержащиевирус Клетки,содержащиевирус Концентрациякле"токО Кои- центрация кле- ток 1 О- мл Клетки.содержащиевирус евм е щее о кл/мп 1 О. 2кл/мл Ю В М кл/мл Х 1,2 46 0,5О О 75 1,2 Ов 52 52 Оебо 021 36 оь 5 Оэ 52 52 О, 11 15 0,65 О, 12 18 1,2 0,26 22 0,11 0,50 0,60 0,06 0,58 0,06 0,60 0,13 22 0,06 6 1,0 . 0,14 14 0,75 0,1 Э 17 0,035 0,35 10 1,0 Т а б л и ц а 2 АВС Ахо 11 г АгА г11 б 11 в Условия ИнфицированИнфици- рованныеклетки,2 Инфнциров аи ныеклетки,2 Живые клетки,Х Инфицирован-. ныеклетки, Х Живыеклетки,й Живыеклетки,Х Живые клет- хиД Живые клет" кнД Инфициро" ванны клет" кнД Живые клет- кнД ные клетки,Х 4 дня инкубации 93,5 0 93,5 0 93,5 0 93,5 0 40 44 62 22 67 20 75 .16 75 14 40 44 50 41 77 36 7731 93 22 40 44 40 55 25 54 65 18 50 88 20. 62 95 20 60 44 40 44 40 40 43 31 45 35 2245 30 16 5231 6 дней инкубации 86 0 86 О 86 0 86 0 86 .0 33 48 33 48 36 48 34 46 34 44 62 41 48 37 62 40 55 33 88 33 33 48 38 36 51 14 56 18 86 14 33 48 35 484 40 36 32 30 28 6Данные выражены в процентах к исходному состоянию 1,21 О клеток в 1 мл,Примечание,еТаблица 3 Вещество Подавление роста при концентрации 0,5 иИ,7 Н 9/ШВ М1 а11 а111 аАЕТ 30 100 КонтрольКонтроль +вирусКонтроль +вирус + 1 мкмКонтроль +вирус + 5 мкмКонтроль. +вирус + 10 мкм Клетки (контроль) 93,5 Клетки + + вирус 40 + 1 мкИ 48 + 5 мкИ 60+ 10 мкИ 721548182 ОднЯ К АзС днец 12 30 б А Составит Г. Коннова абации едактор Н. Гунь хред рект. Кравчук раж 31 Подп е п твенног венка-издательский комбин тент",Гага роищ Зака ВБВБ комитет Москва,эобретенияРаушская и открытиям при ГКб., д. 4/5