Способ выявления вируса человеческого иммунодефицита у животного и человека

(46) (31) (32) (33) (71) ( ) 3697 7.12 Обу 87 Хем Вилл Опы еме унны ных(56) сов но 198 (54) ВЕ ВО ел к НТ 1 Ч - 111, ру, лабораторррелированию, 16, р.96, 1985. ИРУСА ЧЕЛОИЦИТА У ЖИн; Вцс 1 СПОС ЕСКО НОГО Исп осо- НК,одит нных ология. Сущы направляе ость иГОС ДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТ ВЕДРМСТВО СССР (ГОс 1 пАтент сссР) САНИЕ ИЗОБ исерч Инк, (ОЯ)ям А.Картер (ОЯ)ы испытания антиные данные по отбпидемическому копачз 1 у, йамге, ч. 3ОБ ВЫЯВЛЕНИЯГО ИММУНОДЕФИ ЧЕЛОВЕКАользование: вируобретения; описа 1 СПИД (синдром приобретенного иммунодея 1 ицита) представляет побои одну ив основных угроз здоровью людей в двадцатом столетии. Вследствие его изменчивой биологической природы, коварных способов распростра ения от индивидума к индивидуму, иск ытого" периода развития болезни, что дела затруднительным само ее обнаружение, СП Д, несомненно, состоит в ряду эпидемиолог ческих проблем, требующих беспрецедентн х усилий. В самом деле, даже при зн чительных затратах, вложенных на увеличе ие надежности диагностики СПИДа, созд нные к настоящему времени методики все еще в недостаточной степени отвечает необходимым требованиям четкого контроля этой проблемы для любой группы населения. мые НИ ингибиторы природной 2 - 5 А тивовирусной защитной системы, ди стические методики и вспомогател средства для лечения вирусных наруш Выделены и идентифицированы индуц мые НИ ингибиторы РНазы 1 больн синдромом заболевания лимфатиче узлов, родственным СПИДУ компле и синдромом приобретенного и нодефицита, У таких пациентов кциональные 2-5 А не спосо активировать РНазу 1 в монояде клетках периферийной крови, эндо ная дзРНК, эндогенная дзРНК, в бенности неспаренная дзР активирует 2 - 5 А-синтетазу, что прив к увеличению концентрации эндоге 2 - 5 А, 4 ил. 1 табл,Существуют различные обозначения ви- д руса иммунодефицита человека (НИ), вирус 1 С 0 СПИДа, выделенный в Пастеровском Инс- е) титуте (Париж, Франция) обозначают как , 1 АЧ в то время как вирус, выделенный в Национальном Институте здоровья (Бефезда шт,Мэриленд, США), обозначают как НТ 1 Ч. В настоящем тексте вирус НИ частот будет называться в его общем значении или же будет обозначаться как НТ 1 Ч - 11, 1 АЧ или НИ, но без намерения провести различия между ними, Более того, термин нНИн в настоящем описании включает всякие любые другие вирусы, которые могут быть связаны со СПИДом, вне зависимости от того выделены ли они или еще нет, Имеется в виду, что НИ в единственном числе1836101 гцд Я Оп 7 Яя С Сгпайя А Фюфи СлюнулПЭимЕщг ТааОЪг.4 Составитель И, Тареева Редактор Техред М.Моргентал Корректор О, КравцоваЗаказ 2992 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ ССС 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5включает любой тип НИ, независимо от его геномного содержания. Аналогично, характерные для СПИДа симптомы в общем виде будут называться, как включающие симптомы, вызываемые НИ (согласно вышеприведенному определению), симптомы РСК (родственный СПИДУ комплекс), симптомы синдрома заболевания лимфатических узлов (СЗЛ) и симптомы, вызываемые другими вирусами, с по существу аналогичной клинической картиной.СПИД следует за прогрессирующими нарушениями иммунной системы, вызванные инфекцией вирусом иммунодефицита человека (НИ). На ранних стадиях болезни ответственные за иммунность клетки становятся дефектными вследствие потери Т-клеток (происходящих из тимуса клеток), экспрессирующих так называемой Т 4-антиген, т,е. той части Т-клеток, которая в основном состоит из фага-помощника и индуктора, Дефицит Т 4 в клетках может привести к определенным видам дефицита в передающейся с помощью клеток иммунности, втом числе; дефицита ЕУ(естественных клеток-убийц) АЛУ (активирован ных лимфокином клеток-убийц) и цитолитичных Т-клеток.СПИД, видимо, является прогрессирующей болезнью, хотя время перехода из одной фазы в другую может меняться, Для фаз развития СПИДа существует классификация, Существуют асимптоматические индивидумы, зараженные НЯ (сероположительные), о чем судят по циркуляции антител к вирусу. Если у них отсутствуют другие маркеры, их относят к больным на ВР-стадии согласно классификации Вальтера Рида Их также называют предРСК/РСК - родственный СПИДУ комплекс, хотя некоторые такие больные могут так никогда и не показать характерных для РСК симптомов, У некоторых таких больных может развиться болезнь лимфатических узлов (ВР 2) и появиться дефицит Т 4-клеток (ВРЗ). Затем происходит снижение способности лимфоцитов претерпевать стимулируемую антигеном п ролиферацию и стимулируемой антигеном способности образовывать гамма-интерферон, и пациенты на такой ВР 4-стадии начинают терять замедленную кожную гиперчувствительность. Больные на ВР 5-стадии обычно становятся вялыми. Они подвержены заражению опоясывающим лишаем, афтозному стоматиту (молочнице) или имеют симптомы РСК, которые включают; продолжительные ознобы, потение по ночам, слабость, понос и/или потерю веса, Этот период РСК обычно также характеризуется прогрессирующим сни 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 жением иммунности, Наконец, больные на ВР 6-стадии подвержены любым инфекциям, т.е, речь идет о СПИДе в "полном расцвете", когда 50 больных умирает в течение 12 месяцев,Описан направляемый НИ ингибитор(ы) естественного 2 - 5 А противовирусного защитного процесса. Сделанные открытия относятся к новым диагностическим и/или лечебным способам, направленным на разнообразные вирусные нарушения (напр.: лишаи, инфекции ретровирусами и т,д.) и/или потенциально также на раковые заболевания,Индуцируемая интерфероном система 2 - 5 А (2 - 5-алигоадениляты) синтетаза-Р Н азаявляется частью защитного механизма организма против вирусных инфекций. Отдельные элементы такой системы включают:зависимую от дзРНК 2 - 5 А-синтетазу,эндогенные 2 - 5 А изависимую от 2 - 5 А эндорибонуклеазу (РНазу .), Дефект в любом из перечисленных элементов системы 2 - 5 А-синтетаза-РНазанеизбежно приведет к полному или частичному упразднению противовирусного действия системы.В сыворотке или моноядерных клетках периферийной крови (МКПК) людей с некоторыми вирусными инфекциями или подвергавшихся лечению интерфероном обнаружена повышенния концентрация 2 - 5 А-синтетазы, Индуцирование 2 - 5 А-синтетазы в МКПК, таким образом, видимо, может иметь потенциальное, хотя и ограниченное значение для диагностики. Более того, повышенная концентрация 2 - 5 А-синтетазы в МКПК указывает на запущенное состояние болезни при некоторых вирусных нарушениях, но и напротив является признаком эффективного лечения интерфероном других вирусных инфекций. Интерферон был найден в сыворотке больных СПИДом, и тем не менее, устойчивое повышение уровня 2 - 5 А-синтетазы показано для больных на стадии перехода от РСК к СПИДУ, Такие громадные лабораторно-клинические несоответствия могут быть объяснены, если считать нефункцинальными другие элементы системы 2 - 5 А-синтетаза-РНаза. Для того, чтобы исследовать такую возможность, необходима характеристика синтетазы 2 - 5 А и ччо и действия РНазы , о чем подробно говорится ниже,фиг,1 представляет собой фотографию результатов электрофореза на пластинке с полиакриламидным гелем, показывающими активацию РНазыпо действиям 2 - 5 А, экстрагированных МКПК людей, страдающих СЗЛ, РСК и СПИДом, что, установлено в1836101 В экстрактах моноядерных клеток периферийной крови (МКПК) людей с синдромом заболевания, лимфатических узлов (СЗЛ), родственным СПИДУ комплексом (РСК) и 5 синдромом приобретенного иммунодефицита (СПИД) замерены компоненты системы 2 - 5 А-синтетаза-РНаза. Как показано, уровень 2 - 5 А-синтетазы в высшей степени завышен у больных СПИДом и находится на 0 базальном уровне у больных РСКом илиСЗЛом, Однако вне зависимости от колебаний колнцентраций 2 - 5 А-синтетазы (2 - 5 А) высокие эндогенные концентрации 2 - 5 А(до 35 нм) обнаружены у больных СЗЛом, 5 РСКом и СПИДом, Экстракты 2 - 5 А на делеоказались функциональными, о чем свидетельствуют испытания на связывание, расщепление рибосомной РНК и испытание с ядро-целлюлозой. Несмотря на повышен ные концентрации эндогенной функциональной 2-5 А, ни для одного из больных СЗЛом, РСКом или СПИДом не могла быть показана активированная РНаза , Однако увсехэдоровыхлюдей РНазав МКПКбыла 5 активирована, даже несмотря нато, что концентрации зндогенной 2 - 5 А составляли менее 5 нМ. Опыты со смешиванием свидетельствуют о присутствии ингибитора РНазыу пяти больных СЗЛом, РСКом и СПИДом, Такой ингибитор может переноситься и может препятствовать индуцируемому 2 - 5 А специфичному для РНазы разрушению рРНК в экстрактах клеток 1929.Один из таких ингибиторов РНазыосаждается трихлоруксусной кислотой (ТХК) и этанолом. Ингибирование действия РНазыснимается обработкой РНазой А или протеазой. Мои исследования предполагают, что в МКПК больных СЗЛом, РСКом или СПИДом эндогенная дзРНК активирует 2 - 5 А-синтетазу, что приводит к увеличению концентрации эндогенных 2 - 5 А. Способности функциональных 2 - 5 А активировать РНазупрепятствует индуцируемой НЧ ингибитор РНазыв МКПК больных СЗЛом, РСКом и СПИДом,Хочу отметить здесь, что определениеконцентрации 2 - 5 А и функционирования РНазыв экстрактах МКПК использованием специфических и чувствительных определений показывает то, что дефект противовирусной системы 2 - 5 А-синтетазаРНазав МКПК больных СЗЛом, РСКом и СПИДом заключается в присутствии ингибитора РНазыно не в синтезе нефункциональных 2 - 5 А, Приводимые здесь данные подчеркивают, что кажущиеся парадоксальными взаимодействия происходящие в инфицированной вирусом клетке могут бытьиспытании на расщепление рибосомной РНК,Фиг,2 представляет собой фотографию результатов электрофореза на пластинке сполиакриламидным гелем, показывающих активацию уровня РНазыв экстрактах КПК, что установлено в испытании по расеплению рибосомной РНК,Фиг.3 представляет собой фотографию езультатов электрофореза на пластинке с 1 олиакриламидным гелем, показывающих осстановление активности по расщеплеию рибосомной РНК и МКПК.Фиг.4 является диаграммой, иллюстриующей систему 2 - 5-олигаденилят - РНа аОткрыто ингибирующее вещество, выеляющееся или понуждаемое к выделеию, клетками, инфицированными ирусами иммунодефицита человека. Этот 2 нгибитор, видимо, физически связан с ферентом РНазой- конечным продуктом в системе 2 - 5-олигоаденилят-РНазы . ириводит к выходу из строя всей иммунной с стемы, что позволяет вирусам бесконт р льно мультиплицироваться. Описаны мет дики идентификации таких ингибиторов л бо непосредственно, либо косвенно по о сутствию РНазыили неактивности РНаз , либо по присутствию промежуточных 30 б охимических веществ в системе 2 - 5- Р аза , при этом ингибитор(ы) служит марк ром для обнаружения присутствия НИ и и родственных вирусов, дающих по сущес ву аналогичную клиническую картину. 35Также обсуждается прогнозирующее з ачение такого маркера с точки зрения р звития СПИДа в полном расцвете у больн х, в частности, больных, имеющих антитера к НИ в периферийной крови и тканях, 40 в ом числе, крови, фракциях крови, клетках трансплантированных органов и клеточных1 экстрактах, Описаны способы активации Ревазыили дезактивации ингибирующего Р азувещества. Частью настоящего изо бретения являются лечебные методы борьб со СПИДом и родственными вирусами и ко троля развития таких вирусов путем акти ации РНазыи/или удаления или дезакти ации ингибирующего РНазувещества 50 (вееществ), или направленного на ингибиторы вируса. В настоящее изобретение включе ы способы получения антител к ук занным вирусам как и ачо так и 1 п чего с и пользованием в качестве антигена спе ци ичного ингибитора РНазыили направля мых вирусом ингибиторов би химических промежуточных веществ в сиотеме 2 - 5 А-РНаза ,теперь объяснены рациональными согласованными биохимическими понятиями,Связанную с акриловыми шариками (1 мг) РНазу А или связанную с карбоксиметилцеллюлозой (1 мг) (Яцаа Спегпса Со, вымачивают в МР 40 лизисном буфере (16) (10 мкл) 2 ч при 30 С, после чего смешивают с экстрактом МКПК (100 мкг на испытание) до окончательного объема 15 мкл и дополнительно инкубируют 2 ч при 30 С, Во время повторного инкубирования содержимое пробирок осторожно несколько раз перемешивают. Контрольные образцы инкубируют без всякого добавления фермента, Иммобилизованные ферменты таблетируют центрифугированием (10000 х 0,5 мин, комнатная температура), Пять микролитров центрифугированных фракций добавляют к экстрактам клеток929 (150 мкг белка на испытание) и проводят испытания по расщеплению рРНК для определения специфичной для РНазы Е активности.Выделенные из экстрактов МКПК эндогенные 2 - 5 А далее характеризуют проведением испытаний по расщеплению рРНК, Образованные при расщеплении РНазойпродукты с выделенными из МКПК 2 - 5 Азначительно отличаются в экстрактах клеток 1929 от продуктов, полученных с аутентичными 2 - 5 А (фиг,1, сравнить полосы 3, 5, 7 и 9 с полосой 10), Например, эндогенные 2 - 5 А, выделенные из МКПК, активирует РНазуиз клеток929 с расщеплением 285 и 185 рРНК и образованием трех специфических продуктов расщепления (фиг,1, полоса 10). Объяснение наблюдаемых различий в продуктах расщепления может заключаться в том, что эндогенные 2 - 5 А, синтезируемые в МКПК, отличаются от аутентичных 2 - 5 А.Для выявления уровня свободной (не - 5 А-активированной) РНазы , являющейся, как в настоящее время установлено, целевым ферментом для 2 - 5 А, использовано испытание с радисвязыванием,Могут быть также использованы и другие целевые ферменты, которые равно уместны в моем открытии. В экстрактах МКПК больных СЗЛом, РСКом и СПИДом уровень свободной РН азыв 5 - 7 раз выше, чем у здоровых людей,табл.1, столбец 4), Однако испытание на радиосвязывание имеет ограниченное значение для образцов, в которых эндогенные 2 - 5 А контактируют с (РзА 4/ Р/рСр за связывание с РНазой 1.згСоответственно, результаты испытаний по радиосвязыванию точно не отражают уровень РНазы , Таким образом, существенно определение уровня 2 - А - активированной РНазы 1, Для достижения этого мною использован новый чувствительный метод, 25 30 35 4045 50 55 5101520 описанный ниже, позволяющий определять активированную РНазув экстрактах МКПК, выделенных всего лишь из одного миллилитра периферийной крови, и этот метод основан на специфичности расщепления 2 - 5 А-активированной РНазы на рРНК.Вследствиетого, что рРНК присутствует в МКПК ниже уровня детектирования, экстракты клеток Н 929 (субклон штамма клеток929 с дефицитом РНазы 1) используют в качестве источника рРНК, Клетки Н 929 депозитированы в Американской Коллекции типовых культур (Роквиль, шт, Мэриленд, США) под регистрационным номером согласно Будапештскому Соглашению. Использованием этого испытания мне удалось показать, что РНазанеактивна в экстрактах МКПК больных СЗЛом, РСКом и СПИДом (фиг,2, полосы 2 - 6), где имеет место высокое внутриклеточное аккумулирование функциональных 2 - 5 А. Экстракты МКПК от всех здоровых людей, подвергшихся испытанию, показали присутствие активной РНазыдающей специфичные продукты расщепления (фиг.2, полоса 7), несмотря на то, что 2 - 5 А присутствует в концентрации 5 нМ (таблица, столбец 2),Мои наблюдения того, что в экстрактах МКПК, инфицированных СЗЛом, РСКом и СПИДом больных, присутствуют биологически активные 2 - 5 А, подняли вопрос - почему же неактивна РНаза , Для определения того, что является ли отсутствие активности РНазы(что очевидно из фи .2, полосы 2 - 6) следствием нефункциональности РНазыили следствием присутствия ингибитора активности РНазыпроведены следующие опыты со смешиванием. Экстракты клеток929, содержащие фукциональную РНазу, смешивают и совместно инкубируют с экстрактами МКПК больных СЗЛом, РСКом и СПИДом. Специфичных продуктов расщепления для РНазыне обнаруживается (фиг,1, полосы 3, 5 и 7),Важно подчеркнуть, что эндогенные 2 - 5 А, ответственные за активацию РНазы(фиг.1, полосы 3, 5 и 7), дают по меньшей мере четырехкратное разбавление относительно клеточных экстрактов, из которых эти образцы происходят (фиг,1, полосы 2, 4 и 6). Эти данные указывают на присутствие нерастворимого в ТХК ингибитора (ингибиторов) РНазы 1 в МКПК больных СЗЛом, РСКом и СПИДом, Такой ингибитор не обнаружен у здоровых людей, поскольку их экстракты МКПК генерируют специфичные для РНазыпродукты расщепления после совместного инкубирования с экстрактами клеток929 (фиг.1, полоса 9). Присутствие функциональных 2 - 5 А и тот факт, что пред 1836101 10прлагаемый ингибитор РНазы осаждается ТСК и этанолом, наводит на мысль о том, что и гибитор РНазыне является аналогом 2 5 А, как недавно идентифицировалось в к еточных культурах, инфицированных 5 ЯЧ - 1 и ретровирусом.Мои опыты с использованием разрушащих ферментов, иммобилизованных на т ердых носителях, дают совершенно новое и едставление о природе ингибитора(инги б торов) РНазы 1, найденных в экстрактахКПК больных СЗЛом, РСКом и СПИДом, Е ли экстракты МКПК больных СПИДом и едварительно инкубируют с иммобилизов нной протеазой или РНазой А и затем 15 с вместно инкубируют с экстрактами клет к 929, активность РНазывосстанавлив ется, о чем свидетельствует появление с ецифичных продуктов расщепления (фиг,3, сравнить полосы 1 и 2 с полосой 3). 20Мои настоящие исследования показы- в ют, что дефект в противовирусной систем 2 - 5 А-синтетаза-РНаза в МКПКбольных С Лом, РСКом и СПИДом может быть отнес н за счет ингибитора РНазы 1, а не за счет 25 о сутствия функциональных 2 - 5 А. Ингибит р РНазыприсутствует в экстрактах М ПК больных СЗЛом, РСКом и СПИДом, чт указывает на возможность существован я ингибитора на всех стадиях развития 30 ти ичных ретровирусных заболеваний и что эт т ингибитор также имеет отношение к различным субострым (хроническим вирусн м) патогенным инфекциям. С учетом моего предыдущего сообщения о том, что во 35 вс х случаях МКПК больных СЗЛом, РСКом ил СПИДом, подвергшихся испытанию, соде жит РНК Н 1 Ч(определено молекулярной ги ридизацией) и центры инфицирования Н ) определено совместным культивирова ни м лимфоцитов), вполне вероятно, что инги итор РНазыиндуцируется вирусом.Открытия, о которых сообщается здесь, предполагает, что репликация вируса модифи 1 ирует систему 2 - 5 А-синтетаза-РНаза45 таким образом, что естественное противовируное состояние не может быть в полной меэе экспрессировано или отрегулировано. Впрлне вероятно, что белок-(и) и РНК-(ы), закодированный Н 1 Ч или другим сосущест ву щим с ним ретровирусом, может ингибиро ать активацию РНазы 1.П р и м е р. Моноядерные клетки перифе ийной крови(МКПК) выделяют на НсоИНувацеке, клетки929 и Н 929 (субклон 1929 55 с ефицитом РНазы Ц получают в культуре с монослоем, цитоплазматические экстракты леток 929 и Н 1929 получают в глицерино ом буфере, экстракты МКПК получают в МР 10 лизионом буфере, все это согласно известным методикам. Концентрация белка в экстрактах в интервале 1 - 15 мкг/мкл,Активность 2 - 5 А-синтетазы определяют в выделенных экстрактах МКПК (50 мкг на испытание) использованием поли (1) -поли(С) - агарозы. 2 - 5 А выделяют из растворимых в ТХК фракций экстрактов МКПК после нейтрализации фреоном - три - н - октиламином. Экстрагированные ТХК 2 - 5 А затем лиофилизуют и вновь растворяют в воде таким образом, что все образцы стандартизованы в обьеме воды до эквивалента в 5 мкг белка на мкл. Концентрации 2 - 5 А, присутствующих в экстрактах МКПК, измеряют в испытании на радиосвязывание с экстрактами клеток 929 в качестве источника РНазы 1, Из 18900 бра рзА 4/ р/рСр (удельная активность 3000 С 1/ммоль), Агпегзйагп добавленных на одно испытание, 9400 бргп связываются с РНазой в отсутствие 2 - 5 А, Примерно 9 - 14% рзА 4/з р/рСр замещается в испытаниях, в которых добавляют 5 мкл выделенных образцов 2 - 5 А. Концентрацию 2 - 5 А в МКПК определяют сравнением с калибровочной кривой для аутентичных 2 - 5 А, и это определение основано на подсчете концентрации цитоплазмического белка в 25 мкг/мл, Концентрацию 2 - 5 А, выделенных из МКПК, также измеряют в испытании с ядро-целлюлозой с клетками 1929 в качестве источника РНазы 1, Активация РНазы 1 в таком испытании основано на превращении поли /Ч/ р/рСр в растворимые в кисзглоте фрагменты, Примерно 5 - 20 оь всего количества поли /Ч/ р/рСр(1500 бргп) расщепляется в присутствии 2,5 мкл выделенных образцов 2 - 5 А, Концентрации определяют по калибровочным кривым для аутентичных 2 - 5 А (см, выше). Уровень свободной РНазыизмеряют испытании на радиосвязывание после добавления 20000 бра РзА 4/ р/рСр к экстрактам МКПК (50 мкг белка на испытание). Полученные результаты приведены в таблице,Активность индуцированного интерфероном фермента (2 - 5 А - синтетазы) в экстрактах МКПК. полученных от больных СЗЛом, РСКом, и СПИДом, измеряют п всго и сравнивают с активностью экстрактов от здоровых людей, как показано в вышеприведенной таблице, Концентрация 2 - 5 А-синтетазы у больных СПИДом (3 и 5) были в 16 и 20 раз выше чем у нормальных пациентов (таблица, столбец 1), И напротив, концентрация 2 - 5 А-синтетазы у больных СЗЛом ( 1), РСКом ( 2) и СПИДом с саркомой Капози (СК) (4) выше всего лишь в 1.3-5 раз, что подтверждает сделанные другимиосновные наблюдения, 1836101Для определения того, являются ли такие измерения и чтго 2 - 5 А-синтетазы указанием на функциональность фермента и ино из МКПК экстрагируют 2 - 5 А. Биологическую активность 2 - 5 А из растворимых в ТХК фракций экстрактов МКПКусиленно характеризуют в испытаниях на радиосвязывание и испытаниях с ядроцеллюлозой. Концентрации 2 - 5 А аналогичны при испытании двумя методами (таблица, столбцы 2 и 3), Сходимость результатов, полученных методами А и В (таблица, столбцы 2 и 3), указывает на то, что 2 - 5 А, выделенные иэ экстрактов МКПК человека, могут связываться и активировать РНазуиз клеток929 в той же степени, что и аутентичные 2 - 5 А.Видимое отсутствие количественной корреляции между уровнями 2 - 5 А - синтетазы и эндогенными 2 - 5 А при СЗЛ, РСК и СПИД (таблица, сравнить столбец 1 со столбцами 2 и 3) может быть впервые объяснено следующим образом. Определение 2 - 5 А - синтетазы в испытаниях п а 1 го основано на частичной очистке через поли (г 1) -поли (гС)- агарозу, соответственно, в таком испытании измеряют только свободную 2 - 5 А-синтетазу, а не 2 - 5 А-синтетазу, активированную п чио с помощью дзРНК. Однако, непосредственно измеряют эндогенную 2 - 5 А - синтетазу плюс деградируемые 2 - 5 А - ферменты (напр,2 - фосфодиэстераза и фосфатазы). Таким образом, аккумулирование 2 - 5 А в МКПК больных СЗЛом, РСКом и СПИДом указывает на низкую активность деградируемых 2 - 5 А - ферментов, Присутствие 2 - 5 А в МКПКтакже указывает нато, что существует эндогенная дзРНК, до сего времени не обнаруживаемая как у здоровых людей, так и у больных СПИДом.Неспаренная двунитевая РНК является известной формой макромолекулярной РНК, в которой дестабилизация двойной спирали препятствует спариванию оснований. Неспаренная дзРНК хорошо известна за ее способность индуцировать интерферон, что указывает на механизм, несвязанный сам по себе с индуцированием интерферона.Типичное лечебное воплощение неспаренной двунитевой РНК является синтетическая дзРНК, образованная комплексом полирибоинизиновой и полирибоцитидиловой) урациловой кислоты, такой как г п г(Сх, Ч или 6)п где х принимает значения от 4 до 29, напрг 1 п (С 12 Ч/и далее называемая АМПЛ И ГЕН ф) Исследованы многие полимерные неспаренные дзРНК, ведущие себя аналогично Амплигену, Ключевое лечебное преимущество неспаренной 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 дзРНК перед другими формами природных и/или синтетических дзРНК заключается в их пониженной токсичности по отношению к человеку и животным. Например,ащрзоп и др. описывают первичные комплексы дзРНК, способные запускать в действие различные, связанные с интерфероном эффекты, однако токсичность подобных соединений исключает их использование для лечения рака или родственных нарушений.Неспаренная дзРНК, как теперь известно, обладает лечебной активностью против определенных опухолей человека, в частности, против рака почки, Хотя в настоящее время существует представление о дзРНК как о чисто "индукторе интерферона", тем не менее дзРНК активны по отношению к определенным опухолям человека, которые вполне устойчивы к интерферону., что в полной мере отражено в заявке на Европейский патент М 83305426,5, автором которой является создатель настоящего изобретения,Вдругой заявке на патент, которая подана 26 августа 1986 под заглавием "Модуляции связанных с вирусом случаев с помощью двунитевых дзРНК" изобретатель описывает ингибирование вируса СПИДа в культуре клеток человека использованием Амплигена в качестве протипной дзРНК.Под "неспаренными дзРНК" имеются в виду такие дзРНК, в которых водородные связи (укладка оснований) между противостоящими нитями остаются сравнительно интактными, т,е. прерываются менее, чем одной парой оснований на каждые 29 последовательных остатков оснований. Термин "неспаренная дзРНК" следует понимать соответственно.ДзРНК может представлять собой комплекс полиинозината и полицитидилата с определенным отношением урациловых оснований или гуанидиновых оснований, напр., от 1 в 5 до 1 в 30 таких оснований (поли 1, поли(СА - 29 х Ч или 6).ДзРНК могут отвечать общей формуле гоп,/С 12 Ип, Другие приемлемые примеры дзРН К обсуждаются ниже.Неспаренные дзРНК, рекомендуемые для использования в настоящем изобретении, основаны на сополинуклеотидах, выбранных среди поля (Сп,Ч) и поли(Сп, 0), где и означает цифровой показатель со значением от 4 до 29, и являющиеся неспаренными аналогами комплексов полирибоинозиновой и полирибоцитидиловой кислот, образованных модифицированием ги, гСп с введением неспаренных оснований(урацила или гуанидина) вдоль нити полирибоцидилата (гСп). Или же дзРНК может происходить из по13 1836101 14 примеры неспаренныхнения в изобретении 15 ивность 2 - 5 А - синтетазы, концентрация эндогенных 2 - 5 А, уровень свободной РНазыа РНаз экстрактах МКПК больных СЗЛом, РСКом и СПИДом исутствие ингиб и, поли(С) дзРНК модифицированием риозильного скелета полирибоинозиновой ислоты (ги), напр., включением 2 - 0 - мелрибозильных остатков, Такие неспареные аналоги гП.гСп, из которых 5 редпочтительны те, которые отвечают обей формуле ги. (С 12, /), описаны Сайег и зо в патентах США В 4130641 и 4024222, писания которых даются здесь в качестве ссылок. Описанные в указанных патентах 10 дзРНК, как правило, приемлемыдля использования согласно настоящему изобрете нию,СцепифичныезРНК для приме в лючают: поли, поли(С 4% поли. Поли(С 7,Ч) поли, Поли(С 1 з,у) поли(1). поли(С 22,Й 20 поли(1), поли(С 2 о,б) пОли(1), поли(С 29,6) и поли. поли(Ср/23 0р. Фармацевтические композиции в соотв тствии с настоящим изобретением вклю ч ют композиции, предназначенные для и рентерального введения в приемлемом ф рмацевтическом носителе. Так могут б ть приготовлены парентеральные раствор, суспензии и дисперсии так, как это 30 т ебуется согласно известным фармаколог ческим методам в стерильной или несод ржащей пирогенов воде в качестве р створителя/раэбавителя, возможно такж с физиологически приемлемыми солями. 35 Количество вводимой неспаренной дзРНК предпочтительно достаточно для достижения пиковой концентрации в крови от 0,01 микрограмма на миллилитр концентрации дзРНК во всей жидкости организма до 1000 микрограмм на миллилитр в систематической системе кровообращения сразу же после введения в точке, удаленной Отместа вливания,Или же эффективное количество может быть добавлено к кровяному продукту непосредственно перед инъекцией реципиенту. В таких случаях врач может просто сослаться на стандартную таблицу для объемов жидкости в организме, в которой приводятся соотношения между весом реципиента и его или ее объемом жидкости, в сумме должно быть объем жидкости организма пациента плюс объем жидкости, приводимой в равновесие с необходимым количеством дзРНК. Пациент весом шестьдесят-семдесят килограмм имеет в организме жидкость объемом примерно пять-шесть литров,Формула изобретения Способ выявления вируса человеческого иммунодефицита у животного и человека, включающий отбор крови с последующей ее обработкой, анализом и вынесением суждения, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что обработку крови проводят на наличие 2 - 5 А- синтетазы и при ее обнаружении судят о наличии вируса человеческого иммунодефицита,стандартное отклонение 9%бопределено в испытании по радиосвязывании /дублировано/определено в испытании с ядро-целлюлозой /дублировано/, стандартное отклонение 1 оопределено в испытании по радиосвязыванию /дублировано/, стандартное отклонение 10/,д определено в испытании по расщеплению рРНК,см, также фиг.1в среднем для 7 контрольных образцов /дублировано/НО - не определялось