Способ получения мутеинов гирудина

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ 168703 РЕСПУБЛИ 5 С 12 й 15/15 ОС ЗОБ ОПИСА К ПАТЕНТУ(ВЕ) УТЕИН цине и здании сродсте спосор 1, Конструкции рудина(Г 2) мутаг личных езом 1 п ного муируют в екомбивергают гонукленую поклеотид ментар- мдвуниормации ировать векто азмид УДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМРИ ГКНТ СССР(72) Майкл Куртни (6 В), Эрик ДеЖерар Луазон (РР) и Ив Лемуань(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МРУДИНА Изобретение относится к мед может быть использовано при с фармацевтических композиций.Цель изобретения - повышение ва мутеинов к тромбину и упрощени ба. Приме а вариантов гир ен чего. Для осуществления направлен тагенеза 1 и 1 тго фрагмент ДН К клон репликативную форму фага, геном р нантного фага выделяют и под гибридизации с синтетическим оли отидом, который несет мутирован следовательность. Этот олигону служит затравкой синтеза компле ной нити, Полученную таким. образо тевую ДНК используют для трансф бактерий, которые будут продуц фаг, несущий искомую мутацию,Плазмида рТ 6720 представляе экспрессий гирудина в Е,соИ, П(57) Изобретение относится к медицине и может быть использовано при создании фармацевтических препаратов. Цель изобретения - повышение сродства мутеинов к тромбину и упрощение способа. Для этого с помощью фрагмента ДНК, в котором кодон для аминокислоты в 47 позиции природной формы гирудина заменен на кодон для лизина или аргинина, конструируют рекомбинантные плазмиднце ДНК рТ 6197 или рТ 61980 и трансформируют ими реципиентнцй штамм дрожжей Я,сегеч 1 з 1 а 1 Т 6 И зр.4. В результате получают штаммы, продуцирующие мутантный гирудин. 3 табл. рТ 6730 получают из рТ 6720 путем присоединения сайта ЕсоР 1 за кодирующей последовательностью гирудина.Фрагмент С 1 а 1-ЕсоР 1 покрывает всю область, кодирующую гирудин, без нескольких 5 -концевых кодонов. Этот фрагмент1 С 1 а.1-ЕсоР 1 клонируют между сайтами Асс 1 и ЕсоР 1 фага М 13, называемого М 13 Т 131. Фаг, происходящий из М 13 Т 6131 и содержащий последовательность гирудина, назван М 13 Т 61919.Синтезируют три олигонуклеотида, каждый из которых способен составить пару с последовательностью 5 - ГТАЦАЦЦГААЦНЦТГАААГв М 13 Т 61919, кроме ее центральной области, которая соответствует желаемой мутации. Последовательности этих нуклеотидов являются следующими: Т 6435 51 - ЦТТТЦАГГГТГЦГТТГТАЦ - 3, Т 6436 5 -ЦТТТЦАГГТТТЦГГТГТАЦ - 3, Т 6437 5 -ЦТТТЦАГТГЦГЦГТТГТАЦ. Эти олигонуклеотиды предназначены для осуществления замещения кодона ААЦ(асн) в М 13 Т 1919 на ЦАЦ(гис) или ААА(лиэ), или ЦГЦ(арг) соответственно,120 пмоль каждого олигонуклеотида фосфорилируют в 100 мкл реакционной среды и примерно 20 пмоль фосфорилировенного олигонуклеотида гибридиэуют с 1 пмоль однонитевой ДНК фага М 13 Т 1919.После гибридизации смеси обрабатывают полимеразой Кленова и лигазой фага 14 и используют для трансфекции штамма Е,со 11 71/18 (щцт 1), Отбирают клетки, которые образуют ионы медленно о роста, коло. нии пересеивают на полную среду, переносят на бумагу 540 для отбора клеток, имеющих мутирован ные фаги,Отбор осуществляют гибридизацией с олигонуклеотидом - затравкой, Таким образом получают три новых фага, имеющих ис. комую мутированню псследовательность; М 13 Т 61921 (асн - - арг), М 13 Т 61924 (асн - ; гис) и М 1 ЗТ 61925 (асн - лиз).С другой стороны повторяют тот же тип эксперимента с олигонуклеотидом Т 434 последовательности 5 -АТТГТААЦТЦТТСТТСТГ - 3 . Этот олигонуклеотид гибридизуют с последовательностью 5 -1 ЦАГААГААТАТТТАЦААТ, локализованной в области 3 последовательности, кодирую 1щей Г 2 с неспаренным триплетом, предназначенным для замены кодона ТАТ(тир ) наба) ГАГ(глу), Таким образом получают мутированный фаг, соответствующий М 13 Т 6192263,. )П р и м е р 2,:.амещенле фрагмента Рз 11-Н 1 пс 111 и (0,6 т,п,о,) в рТ 61828 на мути- рова н н ы Й фрагмент.Плазмида рТ 61828 несет последовательность, кодирующую гиридин, которой предшествует последовательность гена полового ферромона-альфа дрожжей МР все это под контроль промотора РСК, Последовательность МН и гирудина проходят стадию синтеза и созревания в дрожжах, таким образом продуцированный гирудин находится в культуральной среде.Эту плазмиду используют для получения последовательностей мутированного гирудина вместо нативного гирудина.Гидролиз рестриктазами Рвт и Нпд 11 РТ 61828 высвобождает пять фрагментов размером примерно 3,8; 1,9; 1,5; 1,1 и Э,б т,п.о. соответственно, Последний фрагмент содержит только один сайт Асс 1 и один сайт ЕсоВ 1. Область, ограниченная этими двумя сайтами содержит всо последовательносгь гирудина без нескольких 5-концевых кодонов, Фрагмент Нпб 1 - Рм 0,6 т.п.о. вставлен между сайтами 1-,пг 1 и РМ 1 вектора который не имеет ни сейте Есой 1, ни сайта Асс 1,Таким образом плаэмида рТ 61960 имеет один сайт Асс 1 и один сайт Есой 1, лока лизованные в начале и конце последовательности гирудина,Большой фрагмент ДНК, иэ последовательности гирудина, очищают в геле и смвшивают с продуктом переваривания Асс 1 - Есой 1 репликативной формы каждого из мутированных фагов, описанных в примере 1, чтобы реконструировать комбинацию пропро-гирудин с новыми вариантами Г 2, полученными направленной мутацией.Отобраны четыре новых плазмида: рТ 61963(асн - арг), рТ 61964 (тир - глу), рТ 196515 (асн - гис) и рТ 61966(аснлиэ), которыеотличаются от рТ 61960 только мутированными кодонами,Эти последовательности, несущие йутированные кодоны, могут быть выделены в20 виде фрагментов Рзт 1 - Нпб 111 и повторноклонированы в вектор рТ 61826 вместо исходного фрагмента Рвс 1 - Н 1 пб 11.Таким образом получают четыре новыхплазмиды: рТ 61977 (асн -арг), рТ 6197825 (тирглу), рТ 61979 (асн - гис) и рТ 61980(асн - - лиэ), которые отличаются отрТ 61828, описанной выше, только мутацияП р и м е р 3. Клетки дрожжей ТСИзр 430 трансформируют с помощью ДНК рТ 61977,рТ 61978, рТС 1979, рТ 61980, Трансформанты получают в каждом случае и получаютчетыре штамма ТСИзр 4 рТ 61977, ТСЧзр 4рТ 61978, ТСИзр 4 рТ 61979 и ТСЧзр 435 рТ 61980, Сравнивают продуктивность погирудину этих четырех штаммов и ТСЧ 1 зр 4рТ 61828.Засевают 20 мл культуры, после 48 чвыращивания при ЗО С клетки центрифуги 40 руют (5000 об/мин, 5 мин) и анализируютнадосадочные жидкости.Культуру ТСЧ 1 зр 4 рТ 6881 (плаэмида, ненесущая последовательности, кодирующейГ 2) используют в качестве контроля,45 Активность надосадочных жидкостейоценена по их ингибирующему действию наактивность тромбина (протеолитическая активность на синтетический субстрат).Установлено, что ингибирующее дейст 50 вие производимое вариантами арг" илиз, не меньше действия нативного Г 2.47Варианты глу и гис обладают несколькоменьшим ингибирующим эффектом,П р и м е р 4. Ингибирование действия55 тромбина,Используют варианты гирудина, очищенного до 95, и чистый человеческийтромбин, имеющий процент активности, измеренный титрованием активных центров,аавный 92. Концентрации тромбина одиАнтитромбическую активность двух вариантов гирудина и стандартного гепарина изучают на модели Весслера на кроликах и на крысах с тромбопластином как тромбогенным агентом и на модели стаза у кролика. Лекарство вводят кролику внутривенно путем непрерывной перфуэии большого объема. 55-9наковы во всех измерениях и равны 5,5 10М. Реакцию проводят в буфере состава: 0,05М натрий, рН 7,9, 0,18 М КС и 0,1 ПЭГ при37 С, В течение 2 мин проводят преинкубацию для тромбина и гирудина, потом реакцию запускают в ход с счбстоатом,В табл, 1 приведены величины, определенного экспериментально, количества гирудина, необходимого для ингибирования95 такого же. количества человеческого 10тромбина (5,5 10 9 М).Таким образом, ясно, что требуется примерно в четыре 7 оаза меньше гирудина Г 2 - .арг и Г 2 - лиз, чтобы ингибировать то же47 4количество человеческого тромбина, в сравнении с гирудином Г 2,Следовательно, предлагаемые варианты обладают значительно улучшенными ингибирующими свойствами по отношению ктромбину. 20П р и м е р 5, Фармакологическое изучение двух вариантов гитоудина - рекомбинантных Г 2 и Г 2 - Лиз в сравнении со4стандартным гепарином.Цель изучения, 25Оценить два варианта рекомбинантного гирудина и сравнить их антитромбическую эффективность со стандартнымгепарином.Экспериментальные условия, 30Антитромбическую специфическую активность двух рекомбинантных гирудинов вфизиологической сыворотке определяют поингибированию протеолитической активности тромбина на хромозные. 35Антикоагулирующую активность двухгирудинов сравнивают и ч 1 тго в плазме крысы и кролика по продолжительности тромбинового времени и эффекту анти-Илахромогенным методом. 40Кинетику плаэматического исчезновения гирудина после внутренней инъекциибольшого объема наблюдают путем измерения влияния анти-Ила с помощью тромбинового времени и хромогенным методом с 45помощью калибровочных кривых,Полученные плаэматические концентрации после 30 мин непрерывной внутривенной перфуэии у кролика определяют потем же методикам. 50 Модель Весслера на кролике.Используют самцов новозеландскихкроликов, весящих 2,5-3 кг, После анестезии с помощью внутривенной инъекции пентобарбитала натрия (30 мг/кг) каннилируютлевую сонную артерию и изолируют двеяремных вены, накладывают две слабые лигатуры на каждую из них на расстоянии 2,5см одна от другой. Затем кролики получаютили физиологическую сыворотку или раство-ры гирудина или гепарина непрерывнойперфузией в течение 30 мин при расходе 2,5мл/ч. За 2 мин до конца перфузии берутпробы артериальной крови, чтобы определить содержание антикоагулянтов в плазме,За 1 мин до конца перфузии делают инъекцию человеческого стандартизованноготромбопластина в дозе 600 нг/кг точно втечение 30 с в аорту через сонную артерию,Спустя 30 с перфузию прекращают и образуют застой крови, сжимая лигатуры двухсегментов вен в течение 15 мин, Вскрываютяремные вены и извлекают тромбы, промывают в физиологической сыворотке и взвешивают после тампонирования нафильтровальной бумаге,Модель Весслера на крысе.Используют самцов крыс Сираг-Доулей(СД - СОВ) весом примерно 300 г, После анестезии пентобарбиталом натрия интраперитонеальным путем 30 мг/кг) и срединнойлапаротомии высвобождают нижнюю полую вену на 1 см из почечного перекрестья,Накладывают две гибкие лигатуры на расстоянии 1 см,Испытуемые образцы, разбавленныефизиологической сывороткой, вводят внутривенно одним объемом дозой 1 мл/кг за 5мин 40 с или за 1 мин (гепарин) до реализа-.ции венозного стаза. За 40 с до этого стазавводят тромбогенный агент в дозе 25мг/мл/кг в вену пениса в течение 30 мин.Через 10 с после окончания инъекции создают стаз, зажимая обе лигатуры, сначала проксимальную, затем дистальную, Состояниестаэа выдерживают в течение 10 мин,потомтромб извлекают, погружают в 0,38-ныйраствор цитрата, сушат на бумаге досуха ивзвешивают на следующий день после сушки втечение 1 ч при 50 С.Модель тромбоза для застоя крови укролика.Используют самцов новозеландскихкроликов весом 2,5 - 3 кг. После анестезиипутем внутривенного вливания 30 мг/кгпентобарбитала натрия канюлируют левуюсонную артерию и изолируют две яремныевены, на каждую иэ них накладывают двеслабые лигатуры на расстоянии 2,5 см другот друга. Затем кроликам вводят или физи10 35 40 45 50 алогическую сыворотку, или растворы гирудина, или гепарина непрерывной перфузией в течение 30 мин при расходе 2,5 мл/ч, За 2 мин до окончания перфузии делают отборы артериальной крови, чтобы определить плазматическое содержание антикоагулянтов. После прекращения перфуэии создают состояние стаза, зажимая четыре , лигатуры (сначала проксимальную, затем дистальную). Стаз сохраняют 2 ч, потом вскрывают яремные вены и извлекаюттром. бы, промывают в физиологической сыворот.ке и взвешивают после тампонирования на бумажном фильтре.Результаты.Для каждого препарата маточного раствора с концентрацией 1 мг/кг специфическая антитромбиновая активность обоих вариантов гирудина по отношению к человеческому и бычьему тромбинам приведены в табл,2.Специфическая антитромбиновая активность варианта гирудина Г 2 составляет +/-15000 АТЕ/мг и для варианта Г 2-Лиз47 составляет +/-19000 АТЕ/мг. Эти специфические активности превышают ожидаемые.Специфическая активность идентична для человеческого и бычьего тромбинов.Антикоагулирующая активность в плазме крысы и кролика эквивалентна при малых концентрациях обоих гирудинов.Активность варианта Г 2-Лиз значительно4 твыше при более высоких концентрациях, Количество остаточного тромбина в плазме, определенное с помощью хромогенного субстрата, сравнивают после добавления обоих гирудинов до 60 АТЕ/мл, Для лучшей нейтрализации следов остаточного тромбина вариант Г 2-Лиз 17 является более эффективным, Это выражено в разнице значений К.Кинетика исчезновения обоих гируди нов в плазме после внутривенной инъекции большого обьема оказывается сравнимой при определении ее хромогеннцм методом, но несколько различается три определения ее по тромбиновому времени габл,3).Гирудины исчезают согласно двум экспонентам. На первой фазе (распределение) с ериодом полураспада, оавным 3 минисходное количество за 5 мин снижается до 60 для обоих гирудинов, На второй фазе период полураспада равен 16 мин, для Г 2-Лиэ и 28 мин для Г 2, если расчет ведут с учетом тромбинового времени, и 28 и 30 мин соответственно, если используют хромогенный метод. Стандартный гепарин исчезает согласно одной экспоненциальнойфазе, период полураспада равен 9 мин.Концентрации двух вариантов гирудина в плазме, полученные после 30 мин непрерывной перфузии внутривенно кролику, находятся в прямой зависимости отперфузируемых доз (см. табл,4),Антитромбиновые эффекты.На основании фармакологических анализов видно, что при непрерывной перфузии кролику вао 7 иант рекомбинантного гирудина Г 2-Лиз имеет более высокую антитромбиновую активность, чем Г 2 и гепарин, Фармакокинетика обоих вариантов гирудина является идентичной.Исследования показывают, что геморрагическая опасность у кроликов или время кровотечения у крыс, получивших Г 2-Лиз ниже, чем у получивших стандартный гепарин, для каждого вида животного при эквивалентных дозах для модели тромбоза.Таким образом, изобретение позволяет получить рекомбинантные мутанты гирудина, обладающие высоким фармакологическим эффектом. Формула изобретения Способ получения мутеинов гирудина, предусматривающий получение фрагмента ДНК, кодирующего гирудин с помощью сайтспецифического мутагенеэа, конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК, кодирующей мутеины гирудинапутем клонирования фрагмента в вектор, трасформацию полученной ДНК штаммов-реципиентов, культивирование трансформированных штаммов, выделение и очистку целевого продукта, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения сродства мутеинов к тромбину и упрощения способа, получают фрагмент ДНК, в котором кодон для аминокислоты в 47 позиции природной формы НО 2 заменен на кодон для гауз или Агц, конструируют рекомбинантные плазмидные ДНК, рТ 6197 или рТ 61980, а в качестве реципиента используют Яасйощсоэ сегеч 1 з 1 ае ТОИ зр 4,10 1687032 Таблица 1 Таблица 2 Таблица 3 ТТ - тромбиновое время.ЯС - хромогенный субстрат Таблица 4 Составитель Т.ЗабойкинаТехред М,Моргентал Корректор М.Максимишинец Редактор Е.Папп Заказ 3612 Тираж Подписное 8 НИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул, Гагарина, 101