Способ выделения эндонуклеазы рестрикции ара 1

(51)5 С 12 й 9/14 ТЕ ЕЛЬСТВУ для выльэуется гената в этиленг- рисутстся в том, чт Ара 1 испеточного гом- льный полдекстран в ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР ОПИСАНИ К АВТОРСКОМУ С(71) Научно-исследовательский и конструкторско-технологический институт биологически активных веществ(56) Огеепе Р., Неупесег Н. Во 1 чаг Р Вобг 9 цез В, е а 1., А 9 епега 1 гпейоб тог Йе рцг 01 сатоп о 1 гезтгсбоп еплугпез. - Мцс. Ас 1 бз Вез., 1978, ч.5, ЬО, р. 2373 - 2380.Яецг 1 пс 1 .,АМ,Чап бе Чоогбе,А пеа Вемг 1 ст 1 оп епбопцсеазе 1 гогл АсетоЬасТег рамег 1 апцз. - Йцс. Ас 1 бз Везеагс), 1983, ч 11, Ф 10, р.4409 - 4415.(54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ РЕСТРИКЦИИ АРА 1(57) Изобретение относится к микробиологии и генной инженерии, в частности к полИзобретение относится к микробиологии и генной инженерии, в частности к получению эндонуклеаз рестрикции с высокой степенью очистки, свободных от примесных нуклеаз.Рестриктаза Ара 1 является уникальной, не имеет изошизомеров и, следовательно, не может быть заменена какой-либо рестриктазой из другого источника.Целью изобретения является повышение чистоты и увеличение выхода целевого продукта.Способ заключает оделения рестриктазы офракционирование кл о двухфазной системеиликоль (ПЭГ), 2-ный и.,Ж, 1655986 А 1 учению эндонуклеаз рестрикции с высокои степенью очистки, свободных от примесных нуклеаз. Целью изобретения является повышение чистоты и увеличение выхода целевого продукта. Для выделения рестриктазы Ара 1 используется фракционирование клеточного гомогената в двухфазной системе полиэтиленгликоль - декстран в присутствии хлористого натрия. Дальнейшая очистка фермента осуществляется хроматографией на фосфоцеллюлозе и на гидроксилапатите, Способ позволяет получать 420000 ед.акт/г биомассы высокоочищенного препарата фермента, свободного от примеси неспецифических нуклеаз и фосфатаз, выход по активности составляет 51, удельная активность препарата 150000 ед/мг. 5 табл,вии определенной (0,6 М) концентрации хлористого натрия, а дальнейшая очистка фермента осуществляется хроматографией на фосфоцеллюлозе Рс элюцией градиентом(0,15 - 1) М хлористого калия в буфере и хроматографией на гидроксилапатите (ГАП) с элюцией градиентом (0,01; 0,6) М концентрации калийфосфатного буфера рН 7,4. Использование в процессе хроматографий на фосфоцеллюлоэе Ри гидроксилапатите буфера, содержащего определенную (0,1 мМ) концентрацию ЭДТА, ведет к большей стабильности фермента и повышению выхода целевого продукта.Для фракционирования клеточного гомогената в двухфазной системе ПЭГ - декстран оптимальная концентрация йаСравна 0,55- 0,65 М (табл.1), а ПЭГ и декстрана - 7 и 2 соответственно (табл.2).Как видно из табл.2, двухфазная система 7-ный полиэтиленгликоль-ныйдекстран является оптимальной. Двухфазная 5система 4-ный ПЭГ-ныйдекстран посоставу фаз соответствует двухфазной системе 7-ный ПЭГ -2-ный декстран, нопри этом увеличивается объем нижней фазы, что вызывает методические трудности 10при разделении фаз.Подбор концентрации ЗДТА в. элюирующих хроматографических буферах позволяет увеличить выход рестриктазы Ара 1(табл.3). 15Иэ табл.3 видно, что использование оптимальной (0,10 - 0,15 мМ) концентрацииЗДТА значительно увеличивает выход целевого продукта.В табл,4 представлена зависимость выхода эндонуклеазы рекстрикции Ара 1 отконцентрации ЭДТА в хроматографическихбуферах при выделении по известному способу и согласно изобретению.Объем градиента на начальных этапах 25очистки (хроматография на фосфоцеллюлозе) составляет 5-10 объемов хроматографической колонки. При более тонкой очистке(стадия доочистки фермента на гидроксилапатите) объем градиента увеличивают до 15 30- 30 объемов колонки, Объемы колонок рассчитывают в зависимости от емкости сорбента и количества наносимого материала,Начальная концентрация соли в градиентеопределяется концентрацией соли в буфере, Конечная концентрация соли определяется экспериментальным путем.Использование крутых градиентов сказывается на эффективности разделения, а применение пологих градиентов приводит к 40разбавлению фермента, что иллюстрируется данными, представленными в табл,5.Оптимальными концентрациями градиентов при хроматографической очистке целевого продукта являются при 45хроматографии на фосфоцеллюлозе 0,15 -1,0 М КО, и на гидроксилапатите - 0,1 - 0,6М калийфосфата,Способ позволяет получить препаратрестриктазы с высоким выходом (табл.4) и 50очищенный от примесей экзонуклеаз и фосфатаз, тогда как препараты фермента, выделенные по известному способу, содержатпримесные экзонуклеазы,Получение рекстриктазы Ара 1 из 55Асе 1 оЬас 1 ег рамецг 1 апцз.П р и м е р 1. Для получения рестриктазыАра 1 испол ьэуют штамм Асеево Ь ассе гРаз 1 ецг 1 апцз ВК, полученный из Центрального Музея промышленных микроорганизмов института ВНИИ генетика,Все операции по выделению и очистке фермента проводят при +4 С. Активность рестриктазы тестируют методом гидролиза ДНК фага Л с последующим разделением полученных фрагментов электрофорезом на пластинах с 1(,-ным агарозным гелем, Для увеличения разрешающей способности электрофореза в агарозном геле используют метод, основанный на периодическом изменении полярности напряжения, подаваемого на электроды электрофоретической камеры (пульсирующий форез). Для разделения Ара 1 рестриктов ДНК фага Л и нативной ДН К фаза Л используется пульсирующее поле с периодом 1, 2 с в прямом и 0,6 с в обратном направлениях. Реакционная смесь для гидролиза содержит 10 ММ трис-НС 1 рН 7,9; 6 мМ М 9 С 12; б мМ КС 1;10 мМ 2-меркаптоэтанол; 1 мкг ДНК фага Л и 1 мкл фермента. Реакцию проводят при 37 С 10 мин. Электрофорез проводят в 0,06 М трис-ацетатном буфере, рН 7,9, 2 мМ ЭДТА в течение 5 ч при напряжении 100 В, Окрашенные этидий-бромидом (1 мкгlмл) гели просматривают в Уф-свете.За единицу активности принимают количество фермента, которое в оптимальных условиях за 1 ч полностью расщепляет 1 мкг ДНК фага Л, 2 г биомассы АсетоЬассег раз 1 ецг 1 апцз суспендируют в 4 мл буфера экстракции, содержащего 10 мМ трис-НО, рН 7 5; 10 мМ 2 меркаптоэтанол; 01 мМ ЭДТА и 0,1-ный тритон Х, обрабатывают ультразвуком на дезинтеграторе при частоте 20 кГц и амплитуде 17 мкм по 30 с 5 раз с интервалом 30 с для охлаждения смеси,К 6 мл клеточного гомогената приливают 6 мл смеси 21 ф, ПЭГ - декстран, 2,7 мл 4 М натрия хлористого и 3,3 мл деионизованной воды (конечная концентрация ингредиентов - 77 ь-ный ПЭГ, 2-ный декстран, 0,6 М 1 чаС 1), Смесь перемешивают 15 мин, выдерживают 30 мин в ледяной бане и центрифугируют на центрифуге ВеЕгпап С 2-21 при 8000 об/мин 1 ч.Верхнюю фазу сливают и диализуют против 1 л буфера В, содержащего 10 мМ калий фосфат рН 7,4; 10 мМ 2-меркаптоэтанол; 0,1 мМ ЭДТА; 10-ный глицерин. Диализ проводят со смекой буфера (три раза) в течение 6 ч,Отдиализованную фракцию со скоростью 15 мл/ч наносят на колонку 1,5 х 30 см с фосфоцеллюлозой Р, Колонку промывают 50 мл 0,15 М калия хлористого в буфере. Далее для элюции используют линейныйградиент концентрации калия хлористого0,15 - 1,0 М в буфере В объемом 200 мл.Фракции, элюируемые при 0,35 - 0.45 М КСи содержащие основную часть активности,объединяют. 5Ферментный раствор без диалиэа соскоростью 3 мл/ч наносят на колонку 0,9 х 4см с гидроксилапатитом. Элюцию проводятлинейным градиентом концентрации калияфосфорнокислого рН 7,4 от 0,01 до 0,6 М, 10содержащего 10 мМ 2-меркаптоэтанол, 0,1мМ ЭДТА и 10 ф-ный глицерин. Общий ооъем градиента 50 мл. Фракции, элюируемыепри 0,22 - 0,28 М соли, содержащиеактивность рестриктазы Ара 1, объединяют и диализуют против буфера В, содержащего50-ный глицерин. Выход рестриктазы Ара,1 составил 420000 ед,акт./г биомассы, Впрепарате рестриктазы отсутствуют примеси неспецифических эндонуклеаз (сохранение специфической картинырестрикции при инкубации 1 мкг ДНК фага Л с 30 ед, акт. фермента в течение17 ч при 37 С и примеси экзонуклеаз ифосфатаз(фрагменты ДНК, полученные гидролизом 1 мкгДНК фага ЛЗО ед.акт,фермента в течение 1 ч при 37 С сшиваются сДНК-лигазой и повторно гидролизуются рестриктазой). Концентрированные препараты хранят без снижения активности год и 30более при минус 20 С.П р и м е р 2. Эндонуклеазу рестрикцииАра 1 выделяют из 2 г клеток аналогичнопримеру 1, но к клеточному гомогенату приливают 2,5 мл 4 М йаС (до конечной концентрации 0,55 М) и 3,5 мл деионизованнойводы. Выход препарата составил 385000ед.акт./г биомассы.Примеси неспецифических эндонуклеаз, экзонуклеаз и фосфатаз в препарате не 40обнаруживаются,П р и м е р 3. Эндонуклеазу рестрикцииАра 1 выделяют из 2 г биомассыаналогичнопримеру 1, однако к клеточному гомогенатуприливают 2,9 мл 4 М йаС (до конечной 45концентрации 0,65 М) и 3,1 мл деионизованной воды, Выход препарата составил 400000 ед.акт,/г биомассы,Примеси неспецифических эндонуклеаз, экзонуклеаз из фосфатаз в препарате не обнаруживаются.П р и м е р 4. Эндонуклеазу рестрикции Ара 1 выделяют из 2 г клеток аналогично примеру 1, однако буфер В содержит 0,15 мМ ЭДТА. Выход препарата составил 370000 ед,акт,/г биомассы.Примеси неспецифических зндонуклеаэ, экзонуклеаз и фосфатаз в препарате не обнаруживаются.Таким образом, выход рекстриктазы Ара 1 составляет 420000 ед.акт, с 1 г биомассы, В препарате рестриктазы отсутствуют примеси неспецифических эндонуклеаз (сохранение специфической картины рестрикции при инкубации 1 мкг ДНК фага Л с 30 ед. акт. фермента в течение 17 ч при 37 С) и примеси эндонуклеаз и фосфатаз (фрагменты ДНК, полученные гидролизом 1 мкг ДНК фага 30 ед.акт, фермента в течение 1 ч при 37 С сшивзются ДНК-лигазой и повторно гидролизуются рекстриктазой).Формула изобретения Способ выделения эндонуклеазы рестрикции Ара 1, включающий разрушение биомассы ультразвуком, фракционирование лизата и хроматографическую очистку, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения чистоты и увеличения выхода целевого продукта, фракционирование лизата осуществляют в двухфазной системе, содержащей 7 полиэтиленгликоля и 2(, декстрана в присутствии 0,55 - 0,65 М ИаС, хроматографическую очистку фермента проводят последовательно методом ионообменной хроматографии на фосфоцеллюлозе Рв градиенте КС 0,15 - 1,0 М и методом адсорбционной хроматографии на гидроксилапатите в градиенте фосфорно- кислого калия 0,01 - 0,6 М с использованием в элюирующих хроматографических буферах 0,10 - 0,15 мМ ЭДТА.1655986 Таблица 1Фракиноинрование клеточного гомогената я двухФазной системе7. ПЭЖ декстран при различгцях концентрациях НаС 1 Концентрация 0НаС 1 М 0,05 Наличие Лра 1Нрличие примесных нуклсаэ Обнарувиваются следовые количества Таблица 2 Фракциоцирование клеточного гомогсцата црн различных концентрацияхполиэтилеигликоля и декстрапа в присутствии О,Ь М ЮаС 1 ПЭГ, ХДекстран, ХНаличие Ара 1 8,3 7,0 11,25 6,2,4 1,7 3,2 2,0 1,5Таблица Влияние концентрации Э 1 ТЛ на выход Фермента 11,0 О;05 015 0,10 0,3 ЭДТА, мМ 45 47 34 17,3 4,3 Выход, Х Таблица 4Выделение Ара 1 иэ 2 г биомассы 00 цтддии по ИзвестноАктивВыход,у Суммарное коСтадии по предлагаемомуспособу Выход,Е С умма р ное коВыход7 Стадии по известному способу с кон- цйнтрацией ЭДТА 0,1 мМ Суммар ное количест .во, сд акт,1 О Актив ность лич ес ьу способу ед,акт.//мл10 личес во, ед акт, 10 ф во, ед.акт./1084 100 4 5 2 0 Клеточньй эклеточый экакт трак 88 4 2 Биогель Л,5 см ноге м 55 4 1 ГАП