Способ получения очищенной нейраминидазы холерного вибриона

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 19)87 А 1 51)5 С 12 й 9/2 ВИДЕТЕЛ ЬСТВУ ВТОРСКО 2 сударственныи противочумный нькин л. С 12 М 9/24 пчук Ю.ВАбр нова И.Н. Выдел минидазы,прод ющим вибриона ия, 1975, Т.1, й шев ние м. -11, УЧЕНИЯ ОЧИЩЕ АЗЫ ХОЛЕРНОГ гель- компо- агелей ю Н 5,6, ии ферой жид- А, где 1 2 - нейштаммаым спаржа щиххлориовании и ю среду ОСУДЯРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМРИ ГКНТ СССР(56) Патент США М 4071401978 Вертиев Ю.ВЕэеИ,Р Хорлин А.Я., Краси характеристика нейраруемой неагглютинируБиоорганическая химс, 1639 - 1645.(54) СПОСОБ ПОЛНОИ НЕЙРАМИНИДВИБРИОНА Изобретение относится к биотехнологии, к получению ферментов, частности ней.- раминидазы холерного вибриона.Целью изобретения является упрощение и 1 корение способа и увеличение выхода целевого продукта,Способ заключается в том, что используют штамм Езспег 1 сЬа соН Н В 101 рйО 39, В 124 (коллекция государственного научна- исследовательского института стандартизации и контроля медицинских и биологических препаратов им. Л,А,Тарасевича), содержащий гены нейраминидазы холерного вибриона, Культурал ьную жидкость штамма кишечной палочки диализуют против дистилированной воды, концентриру(57) Изобретение относится к биотехноло гии, а именно к получению ферментов, в частности нейтраминидазы холерного вибриона. Целью изобретения является упрощение и ускорение способа, а также увеличение выхода целевого продукта. Способ заключается в том, что используют штамм ЕзспепсЫа соИ НВ 101 рВО 39 М 124, содержащий гены нейраминидазы холерного вибриона. К.ультуральную жидкость диализируют против дистиллированной воды, концентрируют и очищают гель- фильтрацией с использованием трехкомпонентной фильтрующей системы ультрагелей АсА 34:44;54 в соотношении 1:1:1. Элюцию ведут 0,01 М ацетатным буфером, рН 5,6. Удельная активность целевого продукта 4300 ед/мг, выход по активности 83, время очистки 1,5 - 2 ч. Продукт гомогенен по данным Эф в ПААГ в присутствии ДДС-йа, 2 ил. ют, затем разводят и очищаюфильтрацией с использованием 3 нентной фильтрующей системы упьтАсА 34:44:54 в соотношении 1:1:1,ведут 0,01 М ацетатным буфером, рНа фиг.1 показан профиль элюцмента при фильтрации культуральнкости Е соП 124 через ультрагели Ас- оптическая плотность при 280 нм,раминидазная активность,П р и м е р 1. Культивированиепродуцента осуществляют глубиннсабом в колбах на 3000 мл, соде500 мл бульона Хоттингера с 0,1ватага кальция, рН 7,2 при шуттелир30 С в течение 8 - 10 ч. В питательнувносят 5 об.18- часового посевного материала Е.соН М 124, выросшего на среде этого же состава, После выращивания клетки отбрасывают центрифугированием, а культуральную жидкость диализуют против дистиллированной воды и лиофилизируют или концентрируют любым доступным способом в 7 - 10 раз,Для очистки 3 г лиофильно высушенного фильтрата Е,со М 124 растворяют в минимальномколичестве дистиллированной воды и наносят на колонку (2 х 100 см), заполненную последовательно ультрагелями АсА 34:44:54 в соотношении 1:1;1 и уравновешенную 0,01 М ацетатным буфером, рН 5,6, Скорость элюции 60 мл/ч, объем фракций 5 мл. Нейраминидаза опережает пигмент и связанные с ним низкомолекулярные белки и выходит четким, компактным пиком активности. Фракции, обладающие нейраминидазной активностью, объединяют и анализируют чистоту в электрофорезе полиакриламидного геля. Нейраминидазную активность определяют тиобарбитуровым методом, За единицу активности принимают также такое количество фермента, которое отщепляет 1 мкг й-ацетилнейраминовой кислоты от овомуцина-белка куриных яиц в течение 15 мин при 37 С,Удельная активность полученного фермента 4300 ед/мг, Выход по активности83,Таким образом, благодаря эффекту "до 5 зы гена" в клетках предлагаемого штаммапродуцента Е,соП гв 124 получаютвысокоактивную культуральную жидкость(суммарный выход фермента определяется"активностью исходного препарата), а ис 10 пользование для очистки 3- компонентнойфильтрующей системы ультрагелей позволяет одноэтапно получить гомогенный препарат нейраминидазы холерного вибрионав течение 1,5 - 2 ч.15 На фиг,2 приведены результаты электрофореза в 12-ном полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия,подтверждающие гомогенность полученного препарата нейраминидазы,20 формула изобретенияСпособ получения очищенной нейраминидазы холерного вибриона, включающийочистку культуральной жидкости культурыпродуцента, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что,25 с целью упрощения и ускорения способа иувеличения выхода целевого продукта, используют культуральную жидкость штаммапродуцента Езспег 1 сЬа соИ ГИСК В 124, аочистку ведут гель-фильтрацией через сис 30 тему ультрагелей АсА 34:44;54 в соотношении 1:1:1.165598770,86 о,221) 51 Ф,ФСоставитель А. СеменовРедактор Т. Лазоренко Техред М.Моргентал Корректор С; ШевкунЗаказ 2030 Тираж 366 . ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Ж, Рауаская наб., 4/5Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101