Способ получения карбоксипептидазы а из поджелудочной железы свиньи

(71) Научно-производственное объединение "Биолар" и Латвийский государственный университет им.П.Стучки(4) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КАРБОКСИПЕПТИДАЗЫ А ИЗ ПОД 11 ЕЛУДОЧНОД ИЕЛЕЗЫ СВИНЬИ(7) Изобретение относится к способуполучения Ферментного препарата карИзобретение относится к способам получения Ферментных препаратов, а именно карбоксипептидазы А.Цель изобретения - повышение активности целевого продукта и упроще" ние процесса.Изобретение заключается в том, что экстракцию сырья (ацетоновый порошок поджелудочной железы свиньи) проводят 0,005 М трис-НС 1 буфером при рН 7,5-7,6, из полученного экстракта сульфатом аммония при насыщении 0,64-0,66 и рН 7,5-7,6 выделяют белковую фракцию, содержащую целевой продукт, а очистку КПА осуществляют двукратной ионообменной хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе, уразновешенной 0,005 М трис-НС 1 буфером при рН боксипептидазы А (КПА) из поджелудочйой железы свиньи, применяемой в белковой химии для структурных исследований. Цель изобретения - повышениеактивности целевого продукта и упрощение процесса. КПА получают экстракцией сырья 0,005 М трис-НС 1 буферомпри рН 7,5-7,6. Из полученного экстракта сульфатом аммония при насыщении0,64-0,66 и рН 7,5-7,6 выделяют белковую Фракцию, содержащую целевойпродукт. Очистку КПА осуществляютдвукратной ионообменной хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе, уравновешенной 0,005 М трис-НС 1 Ьуфером при рН7,5-7,6. Кристаллизуют из воды.Удельная активность КПА 29,7-32,5 ед/мгбелка. Выход по активности 31,5-324,П р и м е р 1. 0,7 кг свежезамороженных поджелудочных желез свиньи разрезают на кусочки 4-6 мм и оставляют для автолиза при комнатной температуре на 24 ч. Полученную массу обрабатывают 4 раза ацетоном, затем смесью ацетона и эфира (в соотношении 1:1) и эфиром при интенсивном перемешивании в течение 1 мин, высушивают при комнатной температуре. Получают 140 г ацетонового порошкаАцетоновый порошок перед экстракцией размельчают в лаЬораторной мельнице. 140 г ацетонового порошка размешивают с 1400 мл 0,005 М трис-НС 1 буфера с рН 7,5 в течение 45 мин намагнитной мешалке при комнатной температуре. Осадок отделяют центрифугированием при 6000 об/мин в течение60 мин при 4 С. Получают 1300 млэкстракта. рН экстракта доводят до рН57,5 с помощью 1 М раствора НаОН.К экстракту по порциям добавляютсульфат аммония до 0,64 насыщения,поддерживая рН 7,5. Перемешивают30 мин, Выпавшую белковую Фракцию от- .деляютцентрифугированием при6000 об/мин в течение 40 мин и 3 С,".суспендируот в 360 мл 0,05 И трис-НС 1буфера и подвергают диализу против. 150,005 М трис-НС 1 Ьуфера с рН 7,5. доотсутствия сульфата аммония, Осадок,выпавший во время диализа, отделяютцентрифугированием в течение 30:мин. при 6000 об /мин и 4 С и отбрасывают. 20Центрифугат используют для дальнейшейочистки,УХроматограФия проводится при 4 С.На колонку размером бх 25 см, заполйен ную ДЭАЭ-целлюлозой, уравновешенной0,005 И трис-НС 1 буфером с рН 7,5.наносят 400 мл раствора белка, полученного на стадии П 1 со скоростьютечения 30-40 мл/ч, Через колонкупропускают 5 л 0,005 М трис-НС 1 бу"ферного раствора с рН 7,5 для удаления неадсорбированных белков, КПАэлюируют линейным градиентом концентрации: в одном сосуде 1 л 0,005 Итрис-НС 1 буфера с рН 7,5, в. другом1 л 0,3 М натрия хлористого в 0,005 Итрис-НС 1 буфере с рН 7,5, ОбъединяютФракции с удельной активностью КПАне менее 1.2 ед/мг белка. К объединенным Фракциям с активностью КПА добав.ляют сульфат аммоний до 0,64 насыщения и перемешивают 30 мин, Осадок отделяют. центрифугированием в течение1.ч при 6000 об,/мин и.4 фС и растворяют в 45.мл 0,05 М трис-НС 1 буферас рН 7,5. Осадок, выпавший во времядиализа, отделяют центрифугированиеми выбрасывают. Центрифугат в количестве 50 мл наносят на колонку разме.ром 2,9 х 25 см, заполненную ДЗАЭ-целлюлозой, уравновешенной 0,005 И трис"НС 1 буфером с рН 7,5. Скорость течения через колонку 30-40 мл/ч. Черезколонку пропускают 1 л 0,005 М трисНС 1 буфера с рН 7,5 для удаления по"бочных продуктов. КарбоксипептидазуА элюируют линейным градиентом концентрации: в одном сосуде 1 л 0,005 И трис-НС 1 буфера с рН ,5, а в другом 1 л 0,3 И натрия хлористого в 0,005 И трис-НС 1 буфере с рН 7,5, Объединяют Фракции с удельной активностью. КПА не менее 16 ед/мг белка.К элюату медленно по порциям до" бавляют сульфат аммония до 0,64 насыщения и перемешивают 30 мин, Осадокотделяют центрифугированием при 6000 об, /мин в течение 50 мин при 4 фС, растворяют в 20 мл 0,05 М трисНС 1 буФера с рН 7,5 и диализуют про" тив 0,005 М трис"НС 1 буфера с рН 7,5, Осадок отделяют центрифугированием ивыбрасываютПолученный раствор КПА в 0,005 И трис-НС 1.буфере с рН 7,5 диализуют против воды для кристаллизации КПА.Выпавшие кристаллы промывают два разаводой, а.:затем растворяют при рН 6,8(рН доводится гидроокисью натрия) иотделяю нерастворившиеся примесицентрифугированием йри 150000 об /минв течение 3 О мин. Полученйый растворКПА диализуют против воды для перекристаллизации КПА, В образовавшуюсясуспензию кристаллов добавляют 4 ътолуола .(от объема суспензии).Удельная активность 29,7 ед./мгбелка;. выход по активности 32. П р и м е р 2, Приготовление ацетонового порошка аналогично примеру. 1. 140 г. измельченного ацетонового порошка размешивают с 1400 мл 0,005 И трис-.НС 1 буфера с рН 7,5. Осадок отделяют центрифугированием. Получают 1350 мл экстракта. рН экстракта доводят до 7,55 1 И раствором БаОН,К экстракту на холоду при 40 С добавляют сульфат аммония до 0,65 насыщения при рН до 57,55, После центрифугирования выпавшую белковую фрак" цию суспендируют в 0,05 И трис-НС 1 буФере с рН 7,55 и. подвергают диализупротив 0,005 М трис-НС 1 буфера с рН7,55 до отсутствия сульфата аммония.Диализат от стадии 111 наносят наколоНку бх 20 см, заполненную ДЗАЭ"целлюлозой, уравновешенной 0,005 И трисНС 1 буфером 7,55. После отмывки колонки тем же буфером от неадсорбированных белков КПА элюируют линейным градиентом концентрации: в одном сосуде 1 л 0,005 М трис-НС 1 буФера с рН 7,55,а в другом .1 л 0,3 М натрия хлористогов 0,005 М трис-НС 1 буФере с рН 7,55.Объединяют Фракцию с активностью КПАне менее 13 ед./мг белка. КПА из элю 5 152357 ата осаждают сульфатом аммония при 0,60 насыщении и рН 7,55, осадок отделяют центрифугированием, суспендируют в 0,05 М трис-НС 1 буфере с рН 7,55 и освобождают от солей диализом против 0,005 И трис"НС 1 буфера с рН 7,55, Получают 45 мл диализата. Для дальнейшей очистки диализат наносят на колонку 2,9 х 20 см, заполненную ДЭАЭ-целлюлозой, уравновешенной 0,005 М трис-НС 1 буфером с рН 7,55. После промывки колонки этим же буфером КПА элюируют линейным градиентом концентрации; в одном сосуде 1 л 0,005 М трис-НС 1 буфера с рН 7,55, а в другом 1 л 0,3 М натрия хлористого в 0,005 М трис-НС 1 буфере с рН 7,55, Объединяют Фракции, имеющие активность карбоксипептидазы А не ме нее 16 ед./мг белка. Из объединенной Фракции сульфатом аммония при насыщении 0,65 М и рН 7,55 осаждают КПА. Осадок суспендируют в 20 мл 0,05 М трис-НС 1 буФера с рН 7,55 и освобож дают от сульфата аммония диализом против 0,005 И трис-НС 1 буфера.Полученный раствор КПА в 0,005 М трис-НС 1 буфере с рН 7,55 диализуют против воды для кристаллизации КПА. Выпавшие в процессе диализа кристаллы промываю два раза водой, а затем растворяют при рН 0,8 (рН доводится гидроокисью натрия) и отделяют нерастворившиеся примеси центрифугирова- . нием. Полученный раствор КПА диализу- З 5 ют против воды для перекристаллизации КПА. В образовавшуюся суспензию кристаллов добавляют 4,5 1, толуола,Удельная активность 32,5 ед.мг белка; выход по активности 31,54.П р и м е р 3. Ацетоновый порошок из поджелудочной железы свиньи приготавливают аналогично примеру 1.140 г измельченного ацетонового порошка экстрагируют 1400 мл 0,005 И45 трис-НС 1 буфера 7,6, После центрифугирования получают 1400 мл экстракта.К экстракту при 4 ф С добавляют суль. фат аммония до 0,05 насыщенного при рН 7,6. После центрифугирования вы-павшую белковую Фракцию суспендируют в 0,05 М трис-НС 1 буфере с рН 7,6 и подвергают диализу против 0,005 М трис-НС 1 буфера с рН 7,6 до отсутствия аммония.Диализат от стадии 111 наносят на колонку бх 25 см с ДЭАЭ"целлюлозой, уравновешенной 0,005 М трис-НС 1 бу 0 6Фером с рН 7,6. После отмывки колонки тем же буфером КПА элюируют линейным градиентом концентрации; в одном сосуде 1 л 0,005 М трис-НС 1 буфера с рН 7,6, а в другом 1 л 0,3 М 1 ХаС 1 в 0,005 М трис-НС 1 буфере с рН 7,5, объединяются фракции с удельной активностью КПА не менее 12 ед./мг. Из полученной фракции КПА, освобожденную от основной массы побочных белков, осаждают сульфатом аммония при 0,66 насыщении и рН 7,6. Выпавший осадок КПА отделяют центрифугированием, суспендируют в 0,05 М трис-НС 1 буфере с рН 7,6 и освобождают от солей диализом против 0,005 М трис-НС 1 буфера с рН 7,6, Получают 50 мл диализата,Для дальнейшей очистки диализат наносят на колонку 2,9 х 25 см с ДЭАЭ" целлюлозой, уравновешенной 0,005 М трис-НС 1 буфером с рН 7,6. Колонку промывают тем же буфером, а элюирование КПА проводят градиентом концентрацией 0,3 М натрия хлористого в 0,005 И трис-НС 1 буфере с рН 7,6. Объединяются Фракции с удельной активностью КПА не менее 16 ед./мг белка. Из объединенной Фракции сульфат аммония при насыщении 0,66 и рН 7,6 осаждают КПР. Осадок суспендируют в 20 мл 0,05 М трис-НС 1 буфера рН 7,6, диализуют против 0,005 М трисНС 1 буфера с рН 7,6 до отсутствия сульфата аммония.Полученный раствор КПА в 0,005 М трис-НС 1 буфере с рН 7,6. диализуют против воды для кристаллизации КПА. Выпавшие кристаллы промывают два раза водой и затем растворяют при рН 6,8 (рН доводится гидроокисью натрия) и отделяют нерастворившиеся примеси центрифугированием. Полученный раствор КПА диализуют против воды для перекристаллизации КПА. В полученную суспензию кристаллов добавляют 56 то- . луола.Удельная активность КПА 30,2 ед,/мг белка; выход по активности 31,83.П р и м е р 4, Приготовление ацетонового порошка аналогично примеру 1.140 г измельченного ацетонового порошка экстрагируют 1400 мл 0,005 М трис"НС 1 буфера с рН 7,4. После центрифугирования получают 1300 мл экстракта.К экстракту при 4 С добавляют сульФат аммония до 0,63 насыщения при рН 7,4. После центрифугирования выпавшуюбелковую Фракцию суспендируют в0,05 М трис-НС 1 буфере с рН 7,4 иподвергают диализу против 0,005 Мтрис-НС 1 буфера с рН 7,4 до отсутствия сульфата аммония.Диализат на стадии 111 наносят наколонку 6 х 25 см, заполненную ДЭАЭ, целлюлозой, уравновешенной 0,005 Мтрис-НС 1 буфером с рН 7,4, После отмывки колонки тем же буфером КПАэлюируют линейным градиентом концентрации натрия хлористого 0,3 М в0,005 М трис-НС 1 буфере с рН 7,4.Объединяют Фракции с удельной активностью КПА не менее 12 ед./мг белка.Из полученной объединенной ФракцииКПА осаждают сульфатом аммония при0,3 насыщении и рН 7,4. Выпавший осадок КПА отделяют центрифугированием,после чего суспендируют в 0,05 Итрис-НС 1 буфере с рН 7,6 и освобождают от солей диализом против 0,005 Мтрис-НС 1 буфера с рН 7,4. Получают45 мл диализата. 25Полученный диализат наносят наколонку 2,9 х 25 см с ДЭАЭ"целлюлозойуравновешенной 0,005 М трис-НС 1 буфером с рН 7,4. Колонку промываюттем же буфером, а элюирование КПАпроводят градиентом концентрации0,3 И. натрия хлористого в 0,005 Итрис-НС 1 буфере с рН 7,4. Объединя"ются фракции с удельной активностьюКПЯ не менее 16 ед,/мг белка,Из объединенной фракции сульфатомаммония при насыщении 0,63 и рН 7,4осаждают КПА. Осадок суспендируют в20 мл 0,05 М трис-НС 1 буфера с рН7,4, диализуют против 0,005 М трисНС 1 буфера с рН 7,4 до отсутствиясульфата аммония.Полученный раствор КПА в 0,005 Мтрис-НС 1 буФере с рН 7,4 диализуютпротив воды для кристаллизации КПА.Выпавшие кристаллы промывают два разаводой и затем растворяют при рН 6,8и отделяют нерастворившиеся примесицентрифугированием. Раствор КПА диа"лизуют против воды для перекристаллизации КПА. В полученную суспензиюкристаллов добавляют 3 ъ толуола.Удельная активность КПА 20 ед./мгбелка, выход 254.П р и м е р 5. Приготовление аце"тонового порошка аналогично примеру 1.55140 г измельченного ацетоновогопорошка экстрагируют 1400 мл 0,005 Мтрис-НС 1 буфера с рН 7,7, После центрифугирования получают 1350 мл экстракта.К экстракту при 40 С добавляют сульфат аммония до 0,67 насыщения при рН 7,7, После центрифугирования выпав" шую белковую фракцию суспендируют в 0,005 М трис-НС 1 буФере с рН 7,7 и подвергают диализу против 0,005 М трис"НС 1 буфера с рН 7,7 до отсутствия сульфата аммония.Диализат от стадии 111 наносят на колонку бх 25 см с ДЭАЭ-целлюлозой, уравновешенной 0,005 М трис-НС 1 буфером с рН 7,7. После отмывки колонки тем же буфером КПА злюируют линейным градиентом концентрацией 0,3 М натрия хлористого в 0,005 М трис-НС 1 буФера рН 7,7. Объединяются Фракции с удельной активностью КПА не менее 12 ед./мг белка.Из полученной фракции КПА осаждают сульФатом аммония при 0,67 насыщении и рН 7,7. Выпавший осадок КПА отделяют центрифугированием, суспендируют в 0,05 И трис-НС 1 буфере с рН 7,7 и освобождают от солей диализом против 0,005 И трис-НС 1 буфера с рН 7,7. Получают 52 мл диализата.Для дальнейшей очистки диализат наносят на колонку 2,9 х 25 см с ДЭАЭ- целлюлозой, уравновешенной 0,005 М трис-НС 1 буфером с рН 7,7. Колонку промывают тем же буфером, а элюирование КПА проводят линейным градиентом концентрацией 0,3 И натрия хлористого в 0,005 М трис"НС 1 буфере с рН 7,7. Объединяют Фракции с удельной активностью КПА не менее 16 ед./мг белка.Из объединенной фракции сульфатом аммония при насыщении 0,67 и рН 7,7 осаждают КПА. Осадок суспендируют в 20 мл 0,005 М трис-НС 1 буфера с рН 7,7 и диализуют против 0,005 М трисНС 1 буфера с рН 7,7 до отсутствия сульфата аммония. Полученный раствор КПА в 0,005 М трис-буфере с рН 7,7 диализуют против воды кристаллизацией КПА. Выпавшие кристаллы промывают два раза водой и затем растворяют при рН 6,8 и отде" ляют нерастворившиеся примеси центрифугированием. Полученный раствор КПА диализуют против воды для перекрис" таллизации, В полученную суспензию кристаллов КПА добавляют 63 толуола.Удельная активность КПА 22,6 ед./мг белка; выход 28,11.Корректор И.Васильева Заказ 7007/26 Тираж 501 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035 Москва, КРаушская наб., д. 1/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул. Гагарина, 101 9 15235Таким образом, технико-экономический эффект предлагаемого способа заключается в улучшении качества Ферментного препарата карбоксипептидазы А, применяемой в белковой химии для структурных исследований, а также в упрощении технологического процесса за счет сокращения числа стадий. Формула изобретения10 Способ получения карбоксипептидазы А из поджелудочной железы свиньи, включающий экстракцию ацетонового порошка трис-НС 1 буфером, осаждение15 фермента сульфатом аммония, двукратную ионообменную хроматографию наДЭАЭ-целлюлозе в 0005 М трис-НС 1буфере с градиентной элюцией хлористым натрием и последующей кристаллизацией из воды, о т л и ч а ю щ.и йс я тем, что, с целью повышения ак"тивности целевого продукта и упрощения процесса, экстракцию, осаждениеФермента и хроматографию ведут в0,005 М трис-НС 1 буфере рН 7,5-7,6,осаждение проводят при насыщениисульфата аммония 064-0,66 а элюциюс ДЭАЭ-целлюлозы ведут градиентомхлористого натрия 0-0,30 М.