Штамм бактерий сiтrовастеr freundii для биотрансформации фумарата в l-яблочную кислоту

(19) (11) 0 9/88, С 12 Р 7/46 4 С 12 ПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ ВТОРИЧНОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ обретение относитс биотехноицеских пособом кробиоловой прометаллур разовате- металству оргагическименено в м олускои пиц рФюмерии омплексоонекоторы актерийтаммзирующей ия - штамм бГгеипй 1 (ш ысокой синтеильностью биосинтет возраста культуры, пенью конверсии субую кислоту, что позактерий представляют ельные подвижные пер и имотр ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР(54) ШТАММ БАКТЕРИИ С 1 ТРОВАСТЕКРКЕОИ 011 ДЛЯ БИОТРАНСФОРМАЦИИ ФУМАРАТА В Ь-ЯБЛОЧНУВ) КИСЛОТУ(57) Изобретение относится к производству органических кислот микроЬиологицеским способом и может быть использовано в микробиологической, медицинской и пищевой отраслях промышленности, в парФюмерии и металлургйи(в качестве комплексообразователя логии, к производ кислот микробиоло и может быть прим гической, медицин мышленности, в па гии (в качестве к ля при извлечении лов). Цель изобретен рода С 1 ггоЬасгег 3 Г), обладающий в активностью, стаб за, независящей о более высокой сте страта в Ь-яблочн2при извлечении некоторых металлов). Целью изобретения является штамм бактерий СггоЬасгег Егеипс 111 ВКПМ Р В, обладающий высокой синтезирующей активностью, стабильностью биосинтеза, Ьолее высокой степенью конверсии суЬстрата в Ь-яблочную кислоту, что позволит повысить выход целевого продукта. Штамм обладает высоким, относительно стабильным уровнем Фумарат-гидратазы, активность которой мало зависит от возраста и условий выращивания культуры, Это позволяет получать более 991 целевого продукта от потребленного количества суЬстрата. За счет роста предлагаемого штамма бактерий на среде с 3/ Ферментолиэата БВК и последующей иммобилизации нативных клеток бактерий в каррагинан выход целевого продукта повышается.1 табл. воляет повысить выход целевого продукта.Штамм Сг.гоЬассег Ггецпд 1 3 Г и чен из природных субстратов (огород ные почвы) в результате селекции на среде с Формиатом и депонирован в коллекции промышленных микроорганиз мов ВНИИГенетика и имеет регистрационный номер В.Штамм СхггоЬасгег Егеипй 1 ВКПМ Ю 8-4090 характеризуется следующими признаками.МорФологицеские и Физиологически признаки.Клетки б соб. хиальные палочки с закругленными концами размером 0,4-0,5 х 12 нм, капсул и спор не образуют. Факультативные анаэробы. Оптимальный рост наблюдается при 25-30 С. Односуточные колонии на мясо-пептонном агаре (ИПА)круглые, блестящие, прозрачные, однотипные, с ровными краями, диаметром1"2 мм, позднее - серовато-белые,блестящие. При росте на твердых средах вокруг колоний на 3-7-е сут, появляются концентрические круги в, видешвермеров.Рост на мясо"пептонном бульоне(МПБ) обильный, в виде мути,. с серо"ватым оттенком, пленки не образует,в старых культурах муть, осадок. В24-часовых культурах образование индола не наблюдается. Сероводород образует.Штамм растет на жидкой среде из23-ного муравьинокислого кальцияи 0,5-ного пептона, При этом даетмуть по всей пробирке, образует гази плотную пленку мела на поверхностисреды за счет разложения муравьинойкислоты.При росте на молоке происходитподкисление и коагуляция. Рост накартофельном агаре в виде серовато"белого налета. Культура обладает ха"рактерным запахом, Иелатину не разжижает,Отношение к углеводам. Разлагаетс образованием кислоты и газа глюко" З 5зу, фруктозу, галактозу, арабинозу,маннит, ксилозу, крахмал. Лактозусбраживает медленно. Не растет насахарозе, декстрине, дульците, инозите. Используетв качестве источникауглерода пируват, Формиат, фумарат,глицерин. КИС рост не ингибирует. Иа"лонат не использует, может расти .насредах, содержащих в качестве единственного источника углерода 1 Ж,лимон 1ной кислоты,Отношение к азотистым веществам,Хорошо растет за счет аммонийного иаминного азота, пептона. Нитраты восстанавливает до нитритовОбладаеткаталазной активностью,Штамм хорошо растет на лабораторных средах. Не испытывает потребности,в факторах роста, Выращивание бакте"рий длится от 9 до 36 ч, лучше 12" 5518 ч, при значениях величины рН 6,88,0 (лучше при 7,0-7,2) и температуре20-37 С (лучше при 25-30 С). Условия хранения штамма на твердыхсредах (ИПА) под слоем стерильноговазелинового масла или в лиофилизо"ванном состоянии.П р и м е р 1. Односуточные клеткибактерий С,йгеипдИ ВКПМ Нф В смывают с поверхности ИПА 1-2 мл жидкой стерильной водопроводной воды ис помощью стерильной пипетки переносят в стерильную посевную жидкую сре"ду того же состава (МПБ), начальноезначейие величины рН которой равно7,0-7,2. Культуру выращивают 10-12 чпри 28-30 С в качалочных колбах ем"костью 750 мл (обьем среды 50 мл).Затем посевной материал в количестве2-3 вносят в среду того же составаи выращивают в течение 9-72 ч тем жеспособом, в аналогичных качалочныхколбах с объемом среды 125 мл. Клеткиотделяют от среды центрифугированиемпри 8000 об./мин в течение 10 мин,Биомассу суспендируют в 0,01 Мфосфатном буфере (рН 7,8) из расчета6-16 мг белка клеток бактерий в 1 млсуспейзии, Определение Фумарат-гидратазной активности клеток бактерийпроводят известным способом по количеству образовавшейся Ь-яблочной кис"лоты из фумарата калия. Реакцию синтеза молочной кислоты проводят в течение 1 ч при 37 С на качалке при175 об./мин.Удельная активность Фумаразы 9 часовых клеток бактерий С.ггеипйЫ3 г равна 2,6 10 мМ яблочной кислотына мг белка.за 1 с, что соответствует97,9 от потребленного Фумарата; уклеток 24-часовой культуры 3,1 10 мМяблочной кислоты (99,2 Ф от потребленного фумарата), у 48-часовой культуры - 3,0О мИ яблочной кислоты(98,9 от потребленного фумарата) и у72-часовых клеток 2,9 О-мМ мг-с-,что соответствует 98,3 превращениюфумарата в малат,Результаты сравнения фумаратнойактивности штамма с известным штаммом Рагасо 1 оЬасег аеговепоЫез У 743при инкубации целых клеток бактерийс Фумаратом калия в течение 1 ч представлены в таблице,П р и м е р 2, Выращивание биомассы клеток бактерий С.1 геипйЫ ВКПМР Впроводят, как описано в примере 1 в течение 2-14 ч,Реакционная смесь для синтезаяблочной кислоты содержит в 1 мл5 1523569 1,65 мг белка клеток, либо 3,3 мг белка, лиЬо 4,95 мг белка клеток бактерий Определение Фумарат-гидратазной активности проводят известным способом. Потребление фумарата от его исходного количества в реакционной смеси составляет соответственно 52,8 ф 76,8 либо 79,24 с глубиной превращения потребленного фумарата в яблочную кислоту, равной соответственно 87,2 либо 95,3, либо 99,2 Ф,Удельная активность Фумаразы клеток С.Хгецпс 1 Ы ВКПМ 11 Вв зависимости от количества белка, содержа щегося в 1 мл реакционной смеси,соответственно равна либо 5,110 , либо 3, 7 .1 О , либо 2,610мМ на 1 мг белка зас.П р и м е р 3. Односуточные клетки 20 С.йгецпй 11 ВКПМ М Всмывают с поверхности агаризованной (1,5 Ф агара) среды из ферментолизата биомассы микроорганизмов, выросших на углеводородах (3 ферментолизата БВК в во допроводной воде) 1-2 мл жидкой питательной среды того же состава и с помощью стерильной пипетки переносят в жидкую посевную среду того же сос(тава (начальное значение рН 7,2). Культуру выращивают 10-12 ч при 28- 30 С в качалочных колбах емкостью 750 мл с объемом среды 50 мл. Затем посевной материал в количестве 2-3 вносят в среду того же состава и выращивают культуру 12-16 ц тем же способом в аналогичных кацалочных колбах с объемом среды 125 мл. Клетки отделяют от среды центрифугированием при 8000 об /мин в течение 1 О мин.Биомассу суспендируют в 0,0 М фосфатном буФере рН 7,5 (6-20 мг белка клеток бактерий в 1 мл суспензии) и определяют активность Фумарат 45 гидратазы известным методом.Удельная активность фумаразы 12" цасовых клеток бактерий С,ГгеппйЫ, выросших на среде в 3 ферментолизата БВК,равна 2,4 10 мИ яЬлочной кислоты на 1 мг Ьелка клеток бактерий за 1 с, что соответствует 99/-ному . превращению потребленного Фумарата.П р и м е р 4, Односутоцные клетки бактерий С.йгеппс 1 ВКПМ Кф В 55 смывают с поверхности агаризованнои (1,54 агара) среды МПА 1-2 мл стерильной водопроводной воды и с помощью стерильной пипетки переносят в стерильную синтетическую среду со значением величины рН 7,2, приготовленную на дистиллированной воде,следующего состава, Ф: ИаНРО 1,64; КНРОд 0,15; (ИН),ВО0,2; МАМБО7 НО 0,02 СаС 16 НО 0,01; РеВО 4, 0,000051 Мп+ Еп Со+ следы; глюкоза либо глицерин 1,0, Культуру выращивают 24 ц при 28-30 С в кацалочных колбах емкостью 750 мл с объемом среды 50 мл. Затем посевной материал в количестве 3-54 вносят в стерильную. жидкую среду того же состава в аналогичные качалочные колбы с объемом среды 125 мл и выращивают при той же температуре в течение 30- 48 ч.Клетки отделяют от среды центрифугированием при 8000 об,/мин в течение 10 мин, затем биомассу суспендируют в 0,01 М Фосфатном буфере при рН 7,5 из расчета 10-20 мг белка клеток бактерий и определяют активность фумаратгидротазы известным методом.Удельная активность фумаразы клеток бактерий С.йгецпйг ВКПМ Г В, выросших на синтетической среде с глюкозой либо с глицериномсоответст) венно равна 2,9 1 О и 2,11 О мМ яблочной кислоты на 1 мг клеток бакте" рий за 1 с.П р и м е р 5. Выращивание биомассы бактерий С,йгеигк 1 д ВКПМ Г Впроводят либо на МПБ, как описано в примере 1, либо на среде с 31 Ферментолизата БВК, как описано в примере 3.Исходная удельная Фумарат-гидратазная активность клеток бактерий С,йгецпс 1, выросших на среде сМПБ, равня" лась 8,1 1 Ои на среде с ферментолизатом БВК 5,7 10мМ мгс.Часть оЬъема суспензии клеток бактерий хранят в течение 7 сут при(-4) - (6)С в Фосфатном буфере. Ло истечении указанного времени удельная активность Фумаразы клеток бактерий, выросших на МПБ, составляет 82,7/, а на среде с Ферментолизатом БВК 61,43 от исходной удельной активности клеток бактерий.Другую пОловину объема суспензии клеток Ьактерий С,ГгеипйЫ хранят в тецение 7 сут при (-4) - (6)" С в растворе Фумарата. По истечении указанного времени удельная ферментативная активность клеток, выросших на МПБ, составляет 108,6 ь, а на среде с фер 15235 ментолизатом БВК 98,0 от исходной удельной активности клеток бактерий.П р и м е р 6. Выращивание био" массы бактерий С.йгеппдН ВКПМ Р В- т 4090 проводят на МПБ, как описано в примере 1.Полученную суспензию клеток делят пополам и в одной порции определяют удельную активность фумарат-гидратазы, которую принимают за 1001.10Из другой порции суспензии клеток готовят биокатализатор путем иммобилизации нативных клеток бактерий С,йгеипс 1 Ы в каррагинан, Для этого 6 мл физиологического раствора (0,85315 ИаС 1 в дистиллированной воде) помещают в стеклянный химический стакан емкостью 500 мл и добавляют 0,35 г каррагинана. Суспензию каррагинана в физиологическом растворе оставляют на 30-40 мин при комнатной температуре (18-22 С) для набухания. По истечении указанного времени суспензию нагревают на водяной бане до полногоо растворения каррагинана 70-90 С) . Полученный раствор охлаждают до ч 5- 7 С и добавляют 1 мл суспензии кледукта в виде 1-аспарагиновой кислоты составляет от 0-.0,3 до 2,1-2,В ,.П р и м е р 7. Выращивание биомассы бактерий С.йгеппйН ВКПМ й В"090 проводят на среде с ферментолизатом БВК, как описано в примере 3.Полученную суспензию клеток делят пополам и в одной порции суспензии определяют исходную удельную фумаразную активность, которую принимают за 100.Из другой половины суспензии клеток бактерий готовят Ьиокатализатор путем иммобилизации нативных клеток бактерий в каррагинан, как описано в примере 6.Полученный таким образом биокатализатор содержит 0,1028 мг белка в 1 мл реакционной смеси и проявляет удельную активность, равную 2903 от исходной активности нативных клеток. формула и 3 о б р е т е н и яШтамм Ьактерии СгоЬасег йгеппсх ВКПМ Р В-ч 090 для биотрансформа" ции фумарата в 1"яблочную кислоту.С.Хгеипс 1 ЫВКПМ Мф В 4090 Параметры Рагасо 1 оЬясег аего" КепоЫез Г" 7 Цю в 26,0 78 60,9 5,2 0,21 ток бактерий, быстро тщательно перемешивают и смесь охлаждают в течение10 мин на ледяной бане или в морозилке холодильника. Блок иммобилизованных клеток переносят в стеклянныйхимический стакан емкостью ч 00 мл,содержащий 300 мл 0,3 М КС 1, и выдерживают в течение 16 ч при комнатной 35температуре для увеличения жесткостигеля. По истечении указанного времениполученный блок геля с иммобилизованными клетками бактерий протирают че-рез сито с диаметром ячеек 1 мл. Иолученные гранулы биокатализатора промывают 2-3 раза 0,05 М фосфатным буфером с рН 7,5. Определение фумарат-,гидратазной активности проводят известным методом по потреЬлению фумарата и оЬразованию 1.-яблочной кислоты,Полученный таким образом биоката-пизатор содержал 0,8202 мг белкаклеток бактерий в 1 мл реакционной 50смеси и проявляет активность, равную1804 от исходной.При иммобилизации в каррагинанколичество образования побочного проВремя инкубации клеток,чОбразованиеяблочной кислоты, г/лПревращениефумарата вяблочную кислоту,Скоростьтрансформации фумаратав яблочнуюкислоту,г/л чУдельная активность, гяблочной кислоты"г- сухой биомассы мин