Средство, обеспечивающее устойчивость клеток к фаголизису

СОЮЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНИХРЕСПУБЛИН А 1 146375 4 С 12 11 7/О ИЕ ИЗО ЕНИ ОПИ т1 ОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ антирестрикционным механизмом. В 811 - фрагмент ДНК области и и нитета фага лямбда, обеспечивакщ при введении в клетку в составе комбинантных ДНК устойчивость кл к фаговой инфекции, состоит из 2392 п,о., ограничен В 8111 сайта рестрикции с координатами 35711 ,38103 п.о. на ДНК Фага лямбда; с жит интактные гены тех АВ; с 1 ге термочувствительной мутацией 857. определяемой заменами с вместо Т позиции 37589 (хпд ) 437742 (с 1 и часть гена сго с позиции 38041 38103 п,о, ДНК фага лямбда; Рг и. промоторы фага лямбда; 3 сайта Н 1 пй 111 в позиции 36895, 37459, 37742 п.о. 3 табл. ммуий егток ер 57) по Ртй У нГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТПОИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЦТИЯМПРИ ТННТ СССР(71) Институт биохимии и физиологии микроорганизмов АН СССР(54) СРЕДСТВО, ОБЕСПЕЧИВА 1 ОШЕЕ УСТОЙ ЧИВОСТЬ КЛЕТОК К ФАГОЛИЗИСУ(57) Изобретение относится к област микробиологии, биотехнологии и микр биологической промышленности. Целью изобретения является повышение устойчивости культур ЕзсЬегхсЬда соИ к различным бактериофагам,обладающи Изобретение относится к микробиологии, биотехнологии и микробиологической промышленности и представляет собой средство для предотвращения фаголизиса культур ЕзсЬег 1 сЬ 1 а со 1.Целью изобретения является повыше ние устойчивости культур Е,со 11 к различным бактериофагам, в том числе к бактериофагам, обладающим антирестрикционным механизмом. Ве 11 фрагмент ДНК области иммунитета фага лямбда, обеспечивающий повышенный уровень экспрессии генов гех АВ, при трансформации клеток рекомбинантными плазмидами, содержащими этот фрагмент, обеспечивает устойчивость клеток к фаговой инфекции,Наличие активных генов гех АВ Фага лямбда в составе этого фрагмента приводит к ограничению роста некот рых мутантных фагов Т 4(5), Т 5(6), Т 7(7), ф 80(8) в лизогенных клетках в то время как дикие Формы перечисленных фагов растут на лизогенных культурах без ограничения, Повышенная активность генов гех АВ фага лямбда, введенных в клетки Е.со 11 путем трансформации рекомбинантными плазмидами, содержащими область имм нитета фага лямбда и обеспечивающими повышенный уровень синтеза продукто генов гех АВ, по сравнению с лизоге ными клетками, ограничивает рост в этих клетках, диких форм бактериофагов Т 4, Т 5, Т 7 и некоторых других, Повышенный уровень синтеза продукто генов гех осуществляется в клетках Е.со 11 трансформированных рекомби з 1463759 4 нантными плазмидами, содержащими об- Эффективность использования Вр 311ласть иммунитета фага лямбда.с интак- фрагмента ДНК области иммунитета фага тными генами гех АВ и дефектными ге" лямбда в составе рекомбинантных плазнами репрессоров с 1 (термочувстви- мид для повышения устоичивости куль- тельная мутация Гз 857) и сго (деле- тур Е,со 1 к различным бактериофагам ция, Д , или амбермутация, ащб). показана в примерах 1-7. Белки"продукты генов с 1" и сго+ по- П р и м е р 1. Клетки Е.со 1 д давляют экспрессию генов гех АВ, по- В 834 выращивают в 10 мл мясопептонэтому плазмиды с интактными генами 1 О ного бульона (ИПБ) до плотности 4репрессоров с 1 и сго не обеспечивают 10 кл./мл, осаждают центрифугироо культурам Е. со 1:1. достаточной устой- ванием 10 мин при О С (К,б 000 об/мин) промывают дважды 20 мпВ 111 фрагмент ДНК области иммуни- холодного раствора, содержащего;Втета фага лямбда, обеспечивающий при 16 трис"НС 1, РН 7,7 - 0,010, СаС 1 введении в клетку в составе рекомби,1 М, ресуспендируют в 10 мл этого нантных ДНК устойчивость клеток кФагавой инфекции, состоит из; ной бане, ресуспендируют в 1 мл раст пары оснований; ограничен В 811 вора. К 0,3 мл сУспензии клеток досайтами рестрикции с координатамий естр ции с координатами 20 бавляют 20 мкл раствора ДНК плазмиды 35711 и 38103 пар оснований на ДНК Р 1 ЬВЧ 8 с концентрацией 50 мкг/мл, ин-фага лямбда; и содержит интактные кубируют 50 мин при 0 С, 5 мин при гены гех АВ, с 1 ген с термочувстви С., добавляют два объема среды тельной мутацией 857, определяемой ЬВ, выдерживают 30 мин при 37 С и заменами С вместо Т в позиции 37589 2 В высевают на агар, содержащий (хпд) и 37742 (с 1 857), и часть 30 мкг/мл хлорамфеникола, Выросшие гена сго с позиции 38041 по 38103 пар клоны отбирают и определяют их усоснований ДНК Фага лямбда Рг и Рщ. тойчивость к бактериофагам.9+ промоторы Фага лямбда, 3 сайта Бактериофаг Т 5 , выращенный на ИхпИ 11,в позициях 36895, 37459, . ЗО культуре Е.со 11. В 834, высевают на 37742 пар оснований. газон культуры Е, со 1 В 834, трансЭтот фрагмент может быть введен формированной плаэмидай р 1 ЬВЧ 8. К в ранее сконструированные рекомби". 2 мл мягкого агара, приготовленного нантные ДНК (например, плазмиды) с на среде ЬВ с добавкой 10 мм СаС 2, целью повышения устойчивости культуры добавляют при 37 С10 свежих9 к Фаговой инфекции. клеток в 0,2 мл среды и по 1 О час+Плаэмиды использованные в приме- тиц Фага.Т 5 на первые две чашки, поФРах,приведены в табл,1, 10 на вторые две чашки и по О наПлазмиды РТЬ 202, Р 1 Ь 209, рс,1,857 третьи две чашки. Для контроля фаг Т 5содержат Фрагменты области иммунитета 40 высевают аналогично на чашки с газофага лямбда с пониженной активностью ном культуры 1:.со 11 В 834 без плазмиды,огенов гех ЛВ и служат контролем для Чашки инкубируют при 37 С 16 ч ивыявления генов Фага лямбда, сунест- определяют эффективность высева фагавенных для ограничения Роста различ- в. опытных чашках и контрольных. Наных бактериофагов в клетках Е,со 11 45 газоне в опытных чашках не видно неПлазмида Рс 1857 не несет гех АВ- гативных колоний Фага Т 5, Трансформиактивности из-эа делеции в генах рованные клетки устойчивы к Фагу Т 5.гех АВ. Проведенный анализ позволяет заключить, что культура Е.со 11 В 834/Плаэмида р 11.202 имеет очень низкую 50 ,р 1 ЬКЧ 8 устойчива ко всем используеактивность генов гех АВ из-за нали- мым в данной работе бактериофагам,чия интактных генов репрессоров с 1 в том числе и к пнп 434 и к ТЗ ин сго, частично устойчива к фагу Т 7 (менееПлазмида р 1 Ь 209 имеет низкую ак мелких колоний с диаметром околотивность генов тех АВ из-за иитакт-мм), Ограничение Фагов ТЗ и434 ного гена-респрессора сго. определяется наличием в плазмиде генов системы рестрикции-модификацииОстальные плазмиды имеют высокую Е,СОВЧ и присутствием сайтов, узнаваактивность генов гех АВ, емых этой эндонуклеазой, на ДНК этих1463 35 5бактериофагов. Фаг ТЗ ограничиваетсяактивностью генов гех АВ фага лямбда и системой рестрикции Е. СОКЧ, .фаг Т 7, который не имеет на своейДНК сайтов Е.СОКЧ, только активностью5генов тех АВ, а фаг ипш 434 ограничивается только активностью гена,кодирукщего эндонуклеазу рестрикцииЕ.СОКЧ. 10Зависимость устойчивости клетокЕ,со 11 В 834/рЕЬКЧ к бактериофагам оттемпературы культивирования осуществляют аналогично примеру 1, толькочашки с высеянным фагом Т 5 инкубируют 15при 26, 32, 38 С.Показано, что при 26 С на агариэованной среде падение титра фага Т 5составляет около 907., при 32 С падение титра достигает 99,9 Х, при 38 С 20культура полностью устойчива к фагу Т 5.Определение устойчивости клетокЕ,со 11 В 834/рЕЬКЧ 8 к бактериофагампри культивировании в жидкой среде. 25К культуре клеток Е.со 1 В 834,трансформированных плаэмидой рЕ 1.КЧ 8с плотностью 5 1 О кл./мл в ИПБ, до. бавляют фаг Т 5 с множественностью0,3 и инкубируют при 37 С в условиях 30интенсивной аэрации 5 ч. За это вре"мя культура .выходит в стационарнуюфазу, лизиса культуры не наблюдают,так как клетки устойчивы к бактерио фагу Т 5,Аналогично проводят определениеустойчивости клеток Е,со 11/рЕЬКЧ 8к фагу Т 4, ТЗ, Т 7, ф 80, Р 22, Л д 434.В случае фагов Т 4, ТЗ 4 80, Р 22,3434 лиэиса не наблюдают, так какклетки устойчивы к перечисленным бактериофагам и частично устойчивы кфагу Т 7.Определение урржая фага Т 5.Клетки Е. со 1 В 834/рЕЬКЧ 8 выращивают 4в 10 мл ИПВ до плотности 3 108 кл./мл,осаждают центрифугированием (6000,.1 О мин) и ресуспендируют в 1 мл ИПБ.В суспенэию клеток добавляют. фаг 15с множественностью 0,5-0,8 и провоодят адсорбцию фага 10 мин при 10 С.В этих условиях на клетках адсорбируют свыше 90 всего фага (в среднем957), Затем быстро делают разведенияклеток в 10 раз в пробирках с холод- ВБбным ИПБ (10 С) так, чтобы в последнейпробирке было 3"10 кл/мп, Из этойпробирки отбирают аликвоты по 0,1 мпдля титрования фага (титр 1) на га-,759 ,6зоне Е,со 11 В 834 при 37 С, затемсодержимое пробирки делят пополам,нагревают на водяной бане одну пробу до 30 С, вторую до 37 С и инкубируют пробы при указанной температуре и усиленной аэрации 1,5 ч, Затемотбирают аликвоты по 0,1 мл и пробдля второго титрования (титр 2)..Титр 1 равен сумме инфицированныхклеток, дающих фаговое потомство инеадсорбированных инфекционных фаговых частиц. Титр 2 соответствуетурожаю из инфицированных клеток.Отношение титра 2 к титру 1 приближенно характеризует выход фага на однуклетку.Результаты одного из трех независимых опытов представлены в табл.2,в которой приведены также данные,полученные при анализе урожая фаговТ 4 и Т 7, а также при анализе урожаяфагов Т 5, Т 4 и Т 7, выросших на куль"туре Е,со 1 В 834 без плазмиды и сплазмидой рЕЬ 203, которая содержитобласть иммунитета фага лямбда с интактными генами тех АВ и мутантнымигенами респрессоров с 1857, и скоаш 6.Из табл.2 следует, что в клеткахЕ.со 1 х В 834, трансформированных плазмидами с повышенной активностью генов тех,выход фагового потомствазначительно ниже, чем в бесплазмидныхклетках.При повышении температуры культиовирования с 30 до 37 С выход фагаиз клеток Е.со 1 В 834, трансформированных плазмидами рЕЬ 203 и рЕЬКЧ 8,значительно снижается,При инфицировании клеток Е,со 11В 834,трансформированных плазмидой.рЕЬКЧ 8, фагами Т 4 или Т 5 при 37 С,инфицированные клетки не дают фаго-.вого потомства, т.е, инфекция в этихусловиях протекает абортивно.Плазмида рЕЬКЧ 8 сильнее подавляетрост фагов, по сравнению с рЕЬ 203,что возможно объясняется с слабой супрессией мутации ашб гена сго вштамме Е.со 1 д В 834.П р и м е р 2. Осуществляют аналогично примеру 1, испбльзуя вместоклеток Е.со 1 д В 834 клетки Е.со 11С 600.Проведенный анализ позволяет заключить, что клетки Е,со 11 С 600/при выращивании культур на агариэованной и жидкой средах. Урожай бакте".риофагов Т 5, Т 4, Т 7 падает соответственно в 100, 100 и 10 раз.П р и м е р 3. Осуществляют аналогично примеру 1, используя вместо.клеток Е,со 11 В 834 клетки Е.со 1 т С.Проведенный анализ позволяет заключить, что культура Е.со 11 С/ 10/р 1 ЖЧ 8 устойчива ко всем используемым бактериофагам, кроме фага Т 7 при,культивировании как в жидкой. среде,так и на агаризованной среде, К фагуТ 7 наблюдают частичную устойчивость. 15Эффективность защиты от фаголизисазависит от температуры, Оптимальнойтемпературой для осуществления способа является 37-38 С. Урожай бактерио"о,фагов при росте на культуре Е.со 1 х 20С/р 1 ЬК 78 резко понижен по сравнениюс урожаем на бесплазмидном штамме.П р и м е р 4. Осуществляют аналогично примеру 1, используя вместоплазмиды р 1 ЖЧ 8 плазмиду рРЮ 35, 25Трансформацию клеток Е.со 1 В 834плазмидой рУВЭ 35. проводят как описано в примере . Селективная средасодержит 20 мкг/мл ампициллина, Проведенный анализ показал, что клетки З 0Е.со 1 х 3834/рРИВ 35 достаточно устойо.,чивы при 37 С к бактериофагам Т 7 иТЗ при росте как в жидкой так и на,твердой среде.П р и м е р 5, Осуществляют аналогично примеру 4, используя вместоклеток Е,со 1 х В 834 клетки Е,со 1С 600, Проведенный анализ позволяетзаключить, что клетки Есо 1 х С 600//рРВВ 35 при 37 С устойчивы к бактериофагам Т 5 Ф 80, Р 22, К фагам Т 4,Т 7, ТЗ, наблюдают частичную устойчивость при выращивании культур наагариэованной и жидких средах,П р и м е р 6. Осуществляют аналогично примеру 4, используя вместоклеток Е,со 1 В 834 клетки Е.со 1 х С.Проведенный анализ позволяет заключить, что культура Е,соН С/рРВЭ 35устойчива к фагам Т 5,. ф 80, Р 22, 50частично устойчива к фагам Т 4, Т 7,ТЗ, не устойчива к фагу 1434 прикультивировании как в жидкой, таки на агарнзованной среде, Эффективность защиты от фаголизиса зависитот температуры, оптимальная темпера.тура для осуществления способа 37-38 С.П р и м е р 7, Осуществляют аналогично примеру 1, используя вместоплазмиды р 1 БИ 8 плазмиду р 11.203.Проведенный анализ показал, что этаплазмида повышает устойчивость клеток к фаговой инфекции. Урожай фаговпри росте на Е.со 1 В 834/р 1 Ь 203 прио37 С в среднем приблизительно в100 раз ниже урожая при росте на бесплаэмидном штамме в случае фагов Т 4и Т 5 и в 1 О раз ниже в случае фага.Т 7.В табл.З приведены обобщенные результаты примеров 1-7.Устойчивость культур Е,со 11,трансформированных рекомбинантнымиппаэмидами, содержащими Вя 111 фрагмент ДНК области иммунитета фага лямбда к бактериофагам, приведена также в табл.З,Использованный нами ВЕИ 1 фрагмент ДНК области иммунитета фагалямбда с интактными генами гех АВ,термочувствительным геном с 1 857, всоставе рекомбинантных плаэмид обес.печивает устойчивость клетокЕ,со 11 к различным бактериофагам, втом числе к бактериофагам, обладающимантирестрикционным механизмом, посравнению с известным фрагментом.Наличие в составе В 111 фрагмента промотора Рг, регулируемого термочувствительным репрессором с 1, делает этот фрагмент ДНК удобным для конструирования векторов с регулируемой . экспрессией генов. Одновременно клетки Е.со 11, трансформированные этими векторами, делаются устойчивыми к фаговой инфекции.Формул а изобр е тенияПрименение В 8111 фрагмента ДНК области иммунитета Фага лямбда в качестве средства, обеспечивающего при введении в клетку в составе рекомбинантных ДНК устойчивость клеток ЕзсЬегсЫ.а со 1 х к Фаголиэису.1463759 10 Таблиц а 1 Гены области иммунитета фага лямбда Ссылки Ппазмида Маркеры Репликон рМВ 1 гех АВ+, с 1+ сгофгех АВ , с 11 я 857 сго+ Ар" р 1 Ь 202 р 11,209 рсЬ 857 р 5 гех р 1 Ь 203 р 1 ЫЧ 8 рГВР 35 р 1181 гех Ар, ЕСОКЧАр", Тр" гех рМВ 1 гехП р и м е ч а н и еПлазмида р 1 Ь 209 получена по схеме конструиро-,вания плазмиды р 1 Ь 203, но в качестве донораобласти иммунитета используют ДНК фага лямбдас 1857. Таблица 2 Фаг Т Фаг Т ем"ерПЛО 18 р 1 Ь 203 р 1 ЬК р 1 Ь 20 243 119 33 38000 2400 64 41000 470 52 Иб 20 21620 178 5232000 690037000 1110180 45 113470583,т 22 30тр 137 АВ+, с 1 гя 857 сго ААВ ,с 1 гя 857 сгоавбАВ , с 1 ся 857 сго ЛАВ , с 1 гя 857 сгод 313 64 36000 3 О 4300 390 115 19 137 2,Гены области иммунитета Устойчивость трансфо фага лямбда ванных культур н и е, + - культура устойчива к данно тойчива; "+ - частично устойчи