Способ получения дигиталис-антител

,80 145599 51) 4 А 61 К 39/395 ГОСУДАРСТВЕННЫИ НОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИИ ПАТЕНТУ цепь ование пула.(71) Берингер Маннхайм ГМБХ (ЭЕ)(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДИГИТАЛИСАНТИТЕЛ(57) Изобретение относится к областииммунохимии и относится к способуполучения дигиталис-антител. Цельюизобретения является повышение специФичности антител и степени очистИзобретение относится к медицине, а именно к иммунохимии и касается способа получения дигиталис-антител.Целью изобретения является повышение специФичности антител и степени очистки от эндотоксинов.П р и м е р 1. Получение овечьей антидигоксиновой сыворотки.Иммуноген.Дигоксин-глутарнл-о-оксисукцини мид в водном растворе вводится во взаимодействие с протеином, особенно с бычьим глобулином или эдестином (протеином из семян конопли). После отделения избытка производного диго ксина несколько молекул дигоксина на молекулу протеина с концевой дики от эндотоксинов. Способ осуществляется получением специФической антисыворотки, выделением гамма-глобулина, иммуносорбций на иммуносорбенте, представляющем пористое стекло, или силикагель или окись алюминия с объемом пор 1-20 м /г, в котором через этоксилилпропиламин связан дигитоксинальдегид, и расщеплением папаина на иммуносорбенте. При этом дигиталис-антитела элюируют с иммосорбента водной кислотой после предварительного промывания раствором с рН 6,0-7,5. Полученные антитела дополнительно очищают гель-хроматограФией на сеФакрилеи ионооб-менной хроматограФией на ДЕАЕ-целлюлозе ДЕ. СпециФичность полученных антител повышается на 18-203. гитоксозои через глутарильную связываются с протеином.Иммунизация.0,5 мг дигоксин-иммуногена в полном аднованте Фрейнда вводятся внутрикожно здоровым овцам весом не менее 45 кг. Сначала через каждые 2 недели и затем через каждые 4 недели иммуноген в .таком же носителе снова вводится внутримышечно и подкожно для повышения иммуноответа. Спустя 2-4 мес достигается титр в сыворотке животных 1 мг дигоксинспецифического иммуноглдбулина/мп.Отбор сыворотки, аналитика, обра з 145У здоровых животных, которые доСтигли при отборе пробы указанноготитра, минимально в течение годаеженедельно можно отбирать кровьиз шейной вены. В выборочных пробахотбора постоянно контролируется титрс помощью радиоиммунного .теста нлис помощью Ферментоиммунного теста.Константы связывания также определяются в выборочных пробах путемоценки связывания радиоактивно маркированного дигоксина путем определенных разбавлений антисывороточныхПроб. В соответствии с литературойПолучаются величины 5 х 10 -5 х 10 л/моль.Дпя того чтобы поддерживать по возМожности незначительными колебаниясоставе используемой для выделенияАБ-фрагментов антисыворотки, собиаются количества 20-50 л из отдельых отборов нескольких овец,2. Приготовление иммуносорбента.Содержащее амино-группы стекло.Для удаления мелких частиц и примесей 940 г пористого стекла с поверхностью 10 м /г обрабатывают в водной суспензии ультразвуком, затемнагревают в течение 3 ч в среде65 .-ной азотной кислоты при 80-90 С.1 осле вымывания кислоты стекло высушивают при 150 фС. Очищенное стеклоМедленно с обратным холодильникомперемешивается в 2,7 г безводногодиметилсульфоксида с 300 мл 3-(триэтоксисилил)пропиламина в течение20 ч при 85 С. Избыточный силиламинвымывается изопропанолом и аминироВанное стекло снова высушивается(60 С, небольшой вакуум) . Выходпримерно 1,8 г аминопропильногостекла (750 г),Окисление дигитоксина.6 г дигитоксина в 450 мл смесиэтанола с водой (2:1) подвергаютвзаимодействию со стехиометрическиравным количеством перистата натрия(1,7 г) в течение 20 ч при комнатнойтемпературе. Нерастворимый осадокотфильтровывают и удаляют. Надосадочную жидкость упаривают досуха наротационном испарителе. Остаток проь 1 ывается 2 х 100 мл воды, затем высуШивается в вакууме над хлоридом каль. -ция. Выход 4-5 г окисленного дигитоксина,Адсорбент дигитоксин-стекло.4,5 г окисленного дигитоксинарастворяют в 2,25 л смеси этанола5999 с водой (2:1), смешивают с 750 гаминопропильного стекла и медленноперемешивают в течение 20 ч при комнатной температуре. Стекло отфильтровывают. Дигитоксин определяют путем измерения экстинкции в УФ-области (260 нм) и по полученным даннымвычисляют количество фиксированногодигитоксина (заданное значение: 3 мгдигитоксина на мл объема стекла).4 г боргидрата натрия растворяют в1 л бидистиллированной воды, разбавляют 2 л этанола и подают на модифи 5 1 О цированное дигитоксином стекло. Примногократных встряхиваниях в течение2 ч при комнатной температуре устанавливают рН 7,0-7,4 путем добавления 2 мМ соляной кислоты, При этомсначала фиксированному на стекле через лабильные связи типа шиффового 1 Б 20 основания дигитоксину сообщаетсяпрочная степень фиксации. Полученный иммуносорбент тщательно промыва ют этанолом, водой, этанолом, затемвысушивают в слабом вакууме. Выход1,8 г иммуносорбента.Подготовка иммуносорбента длянепосредственного употребления. ЭО Сорбент суспендируют в буфере А(50 ммоль Фосфата с рН,0/0,15 Мхлористого натрия/0,1 азида натрия),подают в стеклянную колонку с фриттой и последовательно промываютраствором 0,5 М хлористого натрияи 0,05%-ного твина, бидистиллированной водой и 1 М пропионовойкислотой, наконец, уравновешиваетсябуфером А. Использованный иммуносор О бент регенерируют путем промывки 1 Мпропионовой кислотой, после чего хранят в буфере А при 4 С. Сорбентможно использовать многократно. Непосредственно перед употреблением 45 свежий сорбент предварительно промывают.3. Получение овечьего антидигоксин-ФАБ-Фрагментов.Используемые раетворы .стерилизуют 5 О в автоклавах или путем мембраннойфильтрации. Используемая для приготовления растворов вода пирогеносвободна за счет дистилляции. Емкости,приборы, а также другие вспомогатель ные материалы (например материалыдля хроматографии) становятся пиро-генно-свободными за счет нагреванияили же путем обработки 05 М гидроокиси натрия.гаемым способом антитела имеют специфичность, которая на 18,27 превьппаетспецифичность антител, получаемыхизвестным способом,Кроме того, получаемые предлагаемым способом антитела также имеютболее высокую степень чистоты, о чемсвидетельствует сравнение данных посодержанию эндотоксина (см.таблицу)П р и м е р 2. Повторяют пример 1, с той лишь разницей, что вразделе 2 используют силикагельс поверхностью 20 м/г, При этомочистку исходного силикагеля осуществляют путем трехкратного суспендирования в 2 л слабо подкисленной азотной кислотой воды с последующим декантированием мелких компонентов накаждой стадии, Получаемые дигиталисантитела имеют то же качество, чтои антитела примера 1.П р и м е р 3. Повторяют пример 1,с той лишь разницей, что в разделе 2используют гель окиси алюминия с поверхностью 1 м /г. При этом очисткуисходного силикагеля осуществляютпутем трехкратного суспендированияв 2 л слабо подкисленной азотной кислотой воды с последующим декантированием мелких компонентов на каждойстадии. Кроме того, иммуносорбентиспользуют в разделе 3 в количестве5,0 л. Получаемые дигиталис"антителаимеют те же качества, что и антителапримера 1.П р и м е р 4. Повторяют пример1 с той лишь разницей, что стадиюэлюации ФЛБ-фрагментов осуществляют:а) 3 ммоль водной Фосфорной кислотыили б) 5 ммоль водной уксусной кислоты, или в) 2 ммоль водной сернойкислоты,Получаемые при этом дигиталисантитела имеют те же качества, чтои антитела примера 1.П р и м е р 5. Повторяют пример 1, однако в качестве растворителя для адсорбции,и расщепленияпапаином применяют лишь буферныйраствор ацетата натрия и уксуснойкислоты (0,5 М, рН 6,0). Расщеплениепапаином проводят тем, что раствор240 мг папаина в 2 л этого буфераподают прямо на колонку, гри этомжидкость пропускают приблизительно .за 30 мин и непосредственно послеэтого пропускание прекращают и раствор еще 5 ч загружают колонку. Непо 40 7 1455999 8 800 мл концентрируют путем ультраФильтрации до объема 150 мп, затемдиализуют по отношению к буферу(15 Мм Фосфата, рН 7,5/0,15 М хлористого натрия).5ХроматограФию повторяют дпя второйчасти ФАБ-лиофилизата на той же колонке. Обе хроматографированные части снова объединяют для дальнейшегоиспользования. Промежуточное хранение первой части осуществляют при(4 С) .б400 мн целлюлозы марки ВЕ(пред"варительно обработанной 0,5 н НС 1и 0,5 н. ХаОН для стерилизации иосвобождения от пирогена) подают вколонку и уравновешивают 10 ммольФосфатного буфера с рН,1. ФАБ-протеин с предыдущей стадии путем ультрафильтрации доводят до концентрации50 мг/мп и затем пропускают черезколонку. ФАБ-протеин вытекает почти 2 б незамедлительно, следы постороннихпротеинов, (например альбумина, ФСфрагменты и т.д.) удерживаются. ФАБпротеин в стоке собирают, в случаенеобходимости концентрируют путемультрафильтрации до 15-20 мг протеина/мп, на электроде значение рНдоводят до 7,0-7, 1 и стерильно фильтруют через мембранный фильтр с вели- .чиной 0,2 ммк. Конечный выход 5-6 говечьего антидитоксинового ФАБ. От 35 Фильтрованный стерильно целевой продукт запивают в стеклянные емкостипри отсутствии микроорганизмов ихранят при -20 С.Дигиталис-антитела, получаемыевпримере 1, содержат 84,8 мг белков в ампуле и имеют связывающую ем-.кость, равную 0,013 мг дигоксина/мгФАБ-Фрагментов. Кроме того, содержа ние эндотоксина (белковой примеси,которая может вызвать. лихорадку иаллергические эффекты) в ампуле составляет 0,22 единицы. Дигиталисантитела, получаемые известным способом, имеют следущие качества: содержание белков 43,8 мг; связывающаяемкость 0,011 мг дигоксина/мг фАБфрагментов; содержание эндотоксинав ампуле 12,8.Сравнение данных по связывающейемкости, являющейся мерой специфичности дигиталис-антител, свидетельствует о том, что получаемые предлаПредварительная очистка овечьейантидигоксиновой сыворотки30 л антисывсротки перемешиваютв течение 1 ч при комнатной теипературе вместе с 300 г аэрозоля дляудаления липопротеинов. После отделения аэрозоля путем центрифугирования из охлажденной до 4 С надосадочной жидкости путем добавки твердогосульфата аммония до концентрации1,8 М осаждают гамма-глобулины, Путем центрифугирования собирают осадок, растворяют в растворе 0,15 Мхлорида натрия (О, 1 азида) и диализуют по отношению к буАеру (15 мМАосфата, рН 7,1/50 мМ хлористогонатрия/0,002 гибитана) при 4 С.Диализат подают на 16,2 л колонкис диэтиламиноцеллюлозой (ДЕ;-52) иэлюируют буАером того же состава,что и буАер для диализа. Выходящийиз колонки вместе с этим буферомпротеин представляет собой служащуюдпя вь 1 целения ФАБ-Фрагментов иммунсглобулиновую Фракцию из овечьейантидигоксиновсй сьворотки. Выходпротеина составляет 500-700 г, Содержание дигоксин-специфических антител примерно 80-90 исходного титрав сьворотке.СпециАическая адсорбция.250 г иммунсглсбулиновой фракциив 10 л раствора с содержанием диго"ксин-специАическогс иммуноглсбулина,равным 15 г, подают в буфер 50 ммолей фосфата/О, 15 М хлористого натрия/0,002 гибитава (рН 70, буФер Б)Этот раствор при комнатной температуре в течение примерно 2 ч прокачивают через колонку, заполненную 2,4 луказанного иммунсорбента. Специфические иммуноглобулиновые Фрагментысвлзьваются на 90 с адсорбентом,Адсорбент прсмьвают буферои Б, к которому добавляют еще 0,35 М хлористого натрия и 0,05%-ного твина, затем уравновешивают буфером В(85 ммсль Аосфата, рН 7,0/0,15 мольхлористого натрия/ 2 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты/10 мИ цистеина/0,01/ гибитан;:, который пригоден для последующего расщепленияпапаинсм,Фериентативная фрагментация,Нагруженный специфическим к дигоксину иимуноглобулином адссрбентсразу переводят в стеклянные емкости и смешивают с 240 мг папаина,145 5 с 99 6растворенного в 2 л буфера С, Примедленном перемешивании с помощьюлопастной металлической мешалки инку-бируют в течение 255 мин при 37 С.5Путеи измерения проб надосадочнойжидкости суспензии-адсорбента в УФФотометре (280 нм) в различные моменты во время инкубации можно проследить за кинетикой выделения протеинаФС и таким образом образования ФАБФрагментов. По окончании инкубацииадсорбент снова загружают в колонкуи промывают буфером Б. Для насыщениясвободными Н-группаии из процессарасщепления папаином в присутствиицистеина адсорбент промывают буфером (75 мМ Аосфата, рН = 7,5/О, 15 Мхлористого натрия/0,01 гибитана),к которому добавляют 10 мИ иодацетамида. Иодацетаиидньгй буфер оставляютна 2 ч при комнатной температуре вконтакте с адсорбентси. Затем с помощью раствора О, 15 моль хлористого25 натрия/0,01% гибитана вьмывают избьгточный иодацетамид и с помощью 30 мИраствора хлористого натрия подготавливают адсорбент для осуществленияэлюации.Элюация (при комнатной температуре) .Для. элюирования специфическихФАБ-Арагментов через колонку пропускают 3 мМ водной соляной кислоты.ЗБФАБ-протеин в стоке из колонны обнаруживают путем измерения УФ-адсорбции(280 нм) и собирают 5-7 л раствора,содержащего примерно 11 г протеина,концентрируют путем ультрафильтрациидо объема 200-250 мл, затем тотчаслиоАилизируют.Гель-проникающая хроматография(4 С).Колонку длиной 1 м заполняют 7,5 л45сефакрила 8-200 и уравновешивают буФером (5 мМ фосфата, рН=7,0/0,5 Мхлористого натрия/0,002% гибитана).Примерно 5 г ФАБ-лисфилизата растворяют в 110 м уравновешивающего буфера и подают на колонку. Путем регистрации УФ-абсорбции в элюате устанавливают ФАБ-пик с молекулярным весом50000 и его собирают. Выход примерно3,75 г гель-хроматографически однородного протеина, Остальные иммуноглобулиновые Аракции высокомолекулярные ФАБ-агрегаты и Фракции сменьшим молекулярным весом отделены.ФАБ-раствор объемом примерно 70014559средственно после этого промывают 4 л свободного от папаина буферного раствора и ФАБ-Фрагменты вымывают 5 ммоль водной уксусной кислоты согласно примеру 4. Результаты соответ 5 ствуют результатам примера 1.П р и м е р 6. Реакцию примера 1 повторяют с той лищь разницей, что хлористый натрий, добавляемый к буФерному раствору С, заменяют 0,2 моль карбоната алюминия. Кроме того, гельФерментативную хроматографию на се" факриле Бзаменяют хроматографией на сефадексе 1 25 М (РЬацпас 1 а Гпе СЬещса 1 е). В этом случае результаты также соответствуют результатам примера 1, доказывая, что не адсорбционное средство, а тип расщепления антител оказывает соответствующий эффект. При этом нет также фазличий, если расщепление проводят не в отдельном сосуде, а непосредственно в колонке.П р и м е р 7Повторяют пример 5,25 причем используют натрийфосфатный буфер (0,5 М, рН=7,5) в качестве растворителя для адсорбции и расщепления папаина и в качестве адсорбирующего средства применяют силикагель с удельной поверхностью 1,0 м 2 /г.Расщепление папаина осуществляют тем, что раствор 240 г папаина в 2 л этого буфера наносят прямо на колонку, причем жидкость течет примерно35 30 мин и после этого прерывают ее течение и раствор еще следующие 5 ч оставляют на колонке, Затем промывают с помощью 4 л не содержащего папаина буфера и ФАБ-Фрагменты вымыва 40 ют с помощью 5 ммоль водной уксусной кислоты согласно .примеру 4 б. Результаты соответствуют примеру 1.П р и м е р 8. Реакцию примера 1 повторяют с тем отклонением, что гель-ферментационную хроматографию осуществляют на геле оксида алюминия с удельной поверхностью 20 м /г. В растворе Фосфатного буфера устанавливают рН=7,0. Также при этом получают результаты, соответствующие примеру 1.Предлагаемый способ позволяет повысить на 18-202 специфичностьПри- Способность к свямер зыванию, мг (диго- В ксина/мг ФАБ-фрагмента) Эндотокси,ед, Срав- нение О, 011 О, 013 О, 013 0,012 О, 013 О, 014 0,013 12,8 0,22 0,28 0,87. 0,30 4 а 0,1 4 б 0,50 4 в 0,75 0,13 0,44 О, 12 0,70 0,14 0,26 0,15 99 10антител и значительно повысить степень удаления эндотоксина. Формула изобретенияСпособ получения дигиталис-антител, включающий иммунизацию мпекопитающих дигоксинбелковым антигеном, выделение гамма-глобулина, расщепление папаином, выделение ФАБ-фрагментов на иммуносорбенте с использованием промывки и элюации, гель-фильтрации и ионнообменной хроматографии, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повьппения специфичности антител и степени очистки от эндотоксинов, что антитела адсорбируют на иммуносорбенте, состоящем из пористого стекла, или силикагеле, или окиси алюминия с объемом пор 1-20 м 2/г, в котором через этоксилилпропиламин связан дигитоксинальдегид, антитела расщепляют на адсорбенте, промывку осуществляют буферным раствором с рН 6,0-7,5 и антитела элюируют вод- ной кислотой.