Способ получения биологически активных мукополисахаридов

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК ПИ ОБРЕТЕНИ Ни ПАТЕНТ г ретен втиче(57) Изобре получения б полисахарид ПОЛУЧЕНИЯ БИОЛОГИЧЕУКОПОЛИСАХАРИДОВтение относится к спиологически активныхов, применяемых в ме обуукоциение относится к способу мукополисахаридов (МПС ), антитромболитической аки может быть использован для предупреждения и лебозов и старения тканей, лабораторных исследованиИзобр олучениобладаю ивностью в медицин чения тро же в ях арьиляе го профилямукополисах ридов.Приминъекции грастворяютванной водтитров 111=на близкопорядка 16 створе с поаги, пропитанкрахмалом акционномикаторной б в калием сине-виол оно е р 1, 50 епарина в в в 4500 мл ы при 18 С, /БР исполь ля ия,г годног де соли н еминерали Соотношен мощью инд нон иод ис (появлени в присутсПродол исчеэнове овой окраск).до полного вии ионов И ают реакцию ия нитрита мого ге ют значение эти титрь-170. и до отсутствия ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЦТИЯМПРИ ГКНТ СССР Целью изобретенияов ание те рап ев тиче сиологически активных 801570651(51)5 С 08 В 37/10 // А 61 К 37/18 не, Целью иэоб ия является варьи рование терапе ского профиля мукополисахаридов. Эта цель достига" ется способом, заключающимся в деполимеризации гепарина под действием нитрата натрия в водном растворе при концентрации гепарина 5 мас,Х и нитрита натрия - 0,0435 М при рН 2,5 до полного отсутствия ионовперед выделением целевого прота доводят рН до 7, вводят. этанол и выделившийся осадок растворяют в водном растворе хлористого натрия при рН 3,8, а выцелением целевого продукта проводят при объемном соотношении этанола и реакционной смеси 1:1. 4 ил 1 табл,Полученный раствор энергично перемешивают, а его величину рН снижают до 2,5 путем добавления концентрированной хлористо-водородной кислоты, Затем добавляют 15 г нитрита натрия, растворенного в 300 г воды. Величину рН регулируют до 2,5 путем добавления хлористо-водородной кислоты, и общий объем доводится до 5000 мл. Дают реакции проходить втечение 45 мин, затем проверяют отсутствие остаточных азотистыхотношение этанол : реакционнаясмесь 2:1. Через 48 ч отстаиванияпродукт сцеживают и удаляют всплывшую часть. Осадок вновь растворяютв 9 л деминерализованной воды, Добавляют 1 00 г хлористого натрия иповышают величину рН раствора до 3,8с помощью концентрированной хлористоводородной кислоты, Объем доводятточно до 1 0 л, добавляя деминерализованную воду, и при энергичном перемешивании добавляют 1 О л этанола.Оставляют отстаиваться в течение48 ч. Всплывшую часть сифонируют иу)валяют. Осадок извлекают, промывают этанолом, измельчают и сушат ввакууме. 30 Получают 230 г продукта со следующими харак теристиками: титр 40 ЧБР 52 Е/мг; титр Йин и Весслер 1 Ъ 1) 225 Е/мг; средняя молекулярная масса 4000-5000 дальтон; 1 Ът/ЧЯР 4,3,П р и м е р 2, Способ получения фракций, имеющих, титр 1 Ъ 1 и 7 ЯР в со отношении 4,3. 5000 г годного для инъекции гепарина растворяют в 45 л деминерали 0зованной воды при 18 С. ДеиствуютЯО подобным примеру 1 образом, умножая количество реактивов на. 1 О, т.е. добавляют 1 50 г азотистого натрия в 3 л воды; доводят объем реакционной смеси до 50 л; добавляют 50 г тетрас 5 гидридбората;осаждают с помощью1 00 л этанола; вновь растворяют в 90 л воды; добавляют 1000 г хлористого натрия; доводят окончательный реакции на йодкрахмальную бумагу, проводят проверки через каждые 3- 4 мин.Когда эти проверки станут отрицательными, реакцию считают закон-5 ченной. Затем устанавливают величину рН до 10 путем добавления концентрированного едкого натра, и добавляют 5 г тет 1 агидридбората натрия. , Раствор перемешивают в теченче 15 ч. Не вступивший в реакцию тетрагидроборат натрия уничтожается путем уменьшения величины рН,цо 3,0 с помо-; щью концентрированной хлористо-водородной кислоты. Раствор перемешивают в течение 15 мин, затем регулиру ют величину рН до 7,0 посредством концентрированного едкого натра. Продукты реакции извлекают путем добавления 10 л этанола. Объемное со-. объем до 1 00 л; добавляют в конечномитоге 100 л этанола,Таким образом получают 2230 гпродуктов со следующими характеристиками: титр УБР 54 Е/мг; титр Йини Весслер (1 Ы) 232 Е/мг; средняямолекулярная масса 4000-5000 дальтон.Продукты реакции извлекаются путем добавления 1 0 л этанола, отстаиваются в течение 48 ч, сцеживаются и всплывшая часть удаляется,Осадок вновь растворяют в 9 лводы. Добавляют 100 г хлористогонатрия и понижают величину рН раствора до 3,8 с помощью концентрированной хлористо-водородной кислоты,Объем доводится точно до 1 О л с помощью деминерализованной воды и приэнергичном перемешивании добавляют10 л этанола. Оставляют отстаиваться в течение 48 ч, Всплывшую частьсифонируют и удаляют. Осадок извлекают, промывают этанолом, измельчаюти сушат в вакууме.Получают 230 г продукта со следующими характеристиками: титр 7 ЯР52 Г/мг; титр Йин и Весслер (1 Ч)225 Е/мг; средняя молекулярная масса 4000-5000 дальтон,В примере 3 приведены результатыфармакологических испытаний, проведенных с продуктом примера 1.На фиг. 1-4 приведены кривые, полученные при изучении в лабораторных условиях изменений времени свертьвания, вызванных в плазме кровичеловека возрастающими дозами стан -дартного гепарина и продукта из примера 1,В испытаниях, соотв етств ующих результатам данных на фиг, 3 и 4, использовали плазму без тромбоцитов и обедненную Фактором Х 1.На Фиг. 1 - 4 показаны изменения в секундах у тромбина (фиг, 1 ), кефалин-каолина (Фиг, 2), свертывания в присутствии концентрированного тромбопластина (фиг. 3) и разбавленного тромбопластина (Фиг, 4),.вызванные испытуемыми продуктами, т.е. продуктом из примера 1 (кривые а, а, аи а) и гепарином кривые Ь Ьу Ьи Ь,) в зависимости от соот ветственно использованных доз.Время тромбина и кефалин-каолина представляет собой типы измерения, отражающие действие исследуемых препаратов соответственно на ингибироАктив нос тьанти-Папо Те 5 пи др., Е/мг 1 Ч, ЧБР, 1 И/7 ЯРЕ/мг Е/мг Активность анти-Ха по Тепи др Е/мг Соединения"Стандартный"гепарин 160 160225 52232 541500 60 120-1 70 1 1 20-1704,3 120 1 О Предлагаемое 10 4,3 120252100 20 Известное 5 15вание усиленного Фактора 11 и общее -свертывание. Кривые на фиг. 1 и 2показывают, что ИПС в соответствиис изобретением оказывают значительно меньшее действие, чем действиегепарина, на ингибирование активации протромбина и на уровне общегосвертывания. Фиг. 3 и 4, представляющие явления, более непосредственносвязанные с последовательностью энзиматических реакций, характеристиками наружного свертывания (а именно при относительном отсутствии фактора Х 1 а), показывают эффективностьМПС по изобретению по сравнению сгепарином,П р.и м е р 4. Исследование антитромболитической активности продукта из примера 1 на кролике.Назначение 500 и 1 У кролику вызывает значительную активность против Ха, а общая противосвертывающаяактивность остается относительнонезначительной. Через 2 ч после назначения активность составляет порядка 0,88 Е/мл, а время кефалин-каолина 0,09 Е/мл.Испытания в стеклянной колбе ина живом организме показывают болееселективную активность МПС по изобретению, а именно, на уровне ингибирования Фактора Ха по сравнениюс активностью гепарина,Сравнительные данные по антикоагулирующей активности мукополисахаридов, полученных по предлагаемому 70651 6и известному способам, приведены втаблице.Анализ представленных в таблицеданных свидетельствует о различномтерапевтическом профиле известныхсоединений и полученных по изобретению. Формула изобретения Способ получения биологически активных мукополисахаридов деполимеризацией гепарина в растворе деминерализованной воды в присутствии деполимеризующего агента с выделениемцелевого продукта осаждением эФанолом, о т л и ч а ю щ и й с я тем,что, с целью варьирования терапев" 2 О тического профиля биологически активных мукополисахаридов, в качестведеполимеризующего агента используютнитрит натрия и деполимеризацию осуществляют при концентрации гепарина 25 5 мас.Х и нитрита натрия " 0,0435 Мпри рН 2,5 до полного отсутствияионов БО , перед выделением целевогопродукта доводят рН реакционной смеси до 7 раствором едкого натра, вво дят в нее этанол в объемном соотнопении этанол : реакционная смесь,равном 2:1, и выделившийся осадокрастворяют в водном растворе БаС 3.при рН 3,8, а выделение целевогопродукта проводят при объемном,соотношении этанола и реакционной сме"си 1;1.1570651 Составитель Т. Мартинскаяедактор А. Шаицор Техред, Л. Сердюкова Коррек тор М, Куч еряв Тираж 4 ри ГКНТ ССС комитета йо и Москва, Ж,Производственно-издательский комбинат патент", г. Ужгород, ул. Гагарина, 1 Заказ 1461ВНИИПИ Государственно11303 Подписное бр е те ниям и открытия аушская наб., д. 4/5