Способ получения кристаллов карбоксипептидазы т

СОЮЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНИХРЕСПУБЛИК 5 р 4 С 12 М 9/48, С 07 К 1/О ПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕН ИДЕТЕЛЬСТВУ Н АВТОРСНО(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КРИСТАЛЛОВ КАРБОКСИПЕПТИДАЗЫ Т(57) Изобретение относится к способу получения кристаллов карбоксипептидазы Т, основанному на использовании метода диффузии паров растворителя. К Ферментному раствору в МЕБ-буере: добавляют сульфат аммония, 2-метилпентандиол,4 (МПД) и сернокислый цинк. В качестве насыщающего раство" ра применен раствор аналогичного состава с концентрацией сульфата аммония от 33 до 377. Процесс кристаллизации ведут путем помещения капли ферментного .раствора, нанесенной наФ % ,силиконированное стекло, в герметич- Я ную камеру с насыщающим раствором, содержащим сернокислый цинк, МЕБ- буфер, МПД и сульфат аммония, 1 ил, Сд ОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ(56) Рйегяоп А.Мс. Ргерагас 1 оп апй Апа 1 уя 1 я ой РгоСедп Сгува 1 в, Лойп Яа 1 еу апй вопя. Нею .1 ог 1 с Сйсйеягег Вг 1 я 1 апе Тогопго 81 п 8 ароге, 1982, р. 94.Остерман А.Л. и др. Карбоксипептидаза Т - внеклеточная карбоксипептидаза термоактинОмицетов - отдаленный аналог карбоксипептидаз ,животных. - Биохимия, 1984, т.49, Р 2, с. 292-301. И 2 И 7 А 1Изобретение относится к молекулярной биологии, точнее к белковой кристаллографии, и может быть использовано при исследовании пространст венной структуры изучаемого белка методом рентгеноструктурного анализа.На чертеже представлено устройство для осуществления способа.Способ получения кристаллов карбо ксипептидазы Т с пространственной группой Рб 22 с параметрами ячейки а=Ь=159,4 Л с=106,9 А и углами Ы 93=о==90 заключается в следующем. Капли раствора фермента в растворе, содержащем осадитель - сульфат аммония, МЕБ-буфер, 2-метил-пентандиол,4, на носят на поверхность силиконированного стекла, объем капель 10 - 30 мкл. Стекло помещают в чашку Петри с пред"20 лагаемым раствором, причем осадитель в более высокой концентрации - насыщающий растор, Края чашки Петри смазывают вакуумной смазкой и накрывают ;стеклом, чтобы образовалась герметич ная камера (фиг,1), Для большей герметичности на поверхность стекла помещают груз, например, в виде стального диска. В такой камере первоначальный объем белковых капель уменьшается за счет перегонки паров растворителя из капли в насьпцающий раствор. Эта перегонка продолжается до тех пор, пока не уравновесятся концентрации фермента и осадителя в капле и в насьпцающем растворе. Вызванное этим увеличение концентрации фермента приводит к выпадению его в виде аморфного или кристаллического осадка.При указанных в предлагаемом спо" собе условиях выращивают изометричные, хорошо ограненные, кристаллы в форме гексагональных бипирамид, достигающие размеров 0,8 х 0,8 х 0,7 мм.По данным рентгенографического исследования кристаллы карбоксипепти-дазы Т имеют параметры элементарнойо оячейки а=Ь=159,4 Л, с=106,9 А. Они принадлежат к пространственной группе Р 622. Для полученных кристаллов собран набор интенсивностей дифракционных отражений с разрешением 3 А.Условия кристаллизации карбокси" пептидазы Т разработаны на основе следующих экспериментальных данных.55 Опыты по выращиванию укаэанных кристаллов проводят в МЕБ-буфере в интервале рН 5,0-8,0 (интервал устойчиности Фермента) при концентрациях Фермента 0,5 - 2,0 Е с использованием в качестве осадителя полиэтиленгликоля, сульфата аммония, 2-метилпентандиола,4 (МПД), в отсутствии и в присутствии ионов цинка.Условия роста следующие. Концентрация Фермента и растворе 1,0 - 1,27, рН раствора 5,9 - 6,2, Осадитель сульфат аммония, Концентрация осадителя в Ферментном растворе 107., в насыщающем растворе 33 - 377 Концентрация сульфата цинка в Ферментном растворе 1 х 10 - Зх 10 М, Температура 4 О25 С, Время роста кристаллов - тричетыре недели.В указанных условиях кристаллы вырастают достаточными по величине, однако значительная часть белка кристаллизуется в виде игольчатых друз, Введение в ферментный и насыщающий растворы 1 Щ концентрации ЗХ подавляет рост друз, и Фермент кристаллизуется в виде гексагональных бипирамип,. Увеличение концентрации сульфата аммония как в ферментном, так и в насьпцающем растворах за указанные пределы приводит к увеличению числа кристаллических зародышей и, тем самым, к уменьшению размеров выращенных крис-. таллов. При уменьшении концентрации сульфата аммония ниже указанного значения роста кристаллов не происходит,П р и и е р 1, Препарат карбокси пептидазы Т хранят в осажденном виде в 80%-ном сульфате аммония. 5 мл сус. пензии Фермента в сульфате аммония центрифугируют при 12 тыс, об/мин, осадок растворяют в 300 мкл 0,05 М МЕЯ-буфера рН 6,0, В течение 24 ч отдиализовывают против 250 мл этого же буфера, центрифугируют раствор при 12 тыс. об/мин, сливают прозрачный раствор. Объем раствора 400 мкл. Измеряют оптическую плотность раствора при 280 нм на спектрофотометре, рассчитывают концентрацию белка, принимая оптическую плотность 0,17-ного раствора за единицу, Оптическая плотность А=14, следовательно, концентрация белка 1,4%.К 400 мкл полученного раствора карбоксипептидазы Т добавляют15,б мкл МПД, 53 мкл 4 М раствора сульфата аммония и 53 мкл раствора ЕпБО с концентрацией 1 х 10 М, Суммарный объем раствора 521,6 мкл,144 45 формула изобретения конечная концентрация фермента10,8 мг/мл, т.е. 1,08%,Полученный раствор каплями .по20 мкл наносят на стекло, которое помещают в чашку Петри с 10 мл раствора, содержащего, мл: сульфат аммония3,5; МПД 0,3; 0,05 И МЕБ-буфер(рН 6,0) 6,2.Чашку герметизируют по описанномуметоду и оставляют при комнатнойтемпературе. Через 3 недели в каждойкапле образовываются кристаллы в видеограненных гексагональных бипирамидразмером до 0,8 х 0,8 х 0,7 мм,П р и м е р 2, 4 мл суспензии фермента в сульфате аммония отцентрифугируют, как в примере 1, растворяютв 200 мкл 0,05 И МЕБ-буфера рН 6,2,отдиализовывают раствор против200 мкл этого же,буфера, центрифугируют, сливают прозрачный раствор. Объем раствора 300 мкл. Измеряют конце 1 трацию Фермента, как описано выше:А=15, концентрация карбоксипептидазыТ 1,5 ,К 300 мкл раствора добавляют12 мкл МГЩ, 40 мкл 4 М сульфата аммония и 40 мкл 2 х 10 И раствора 2 пБО,1,Суммарный объем 392 мкл. Конечнаяконцентрация Фермента 1,15 . Полученный раствор каплями по 25 мкл наносятна стекло, как описано выше, котороепомещают в чашку Петри, В чашке Петрипредварительно помещают 10 мл раствора, содержащего, мл; 4 М сульфат аммония 3,3; ИПЦ 0,3; 0,05 И ИЕБ в буф(рН 6,2) 6,4, далее аналогично примеру 1. Через 4 недели получают кристаллы размером от 0,6 х 0,6 х 0,5 до0,8 х 0,8 х 0,7 мм.Далее приведены примеры, свидетельствующие о существенном влияниина размер и форму кристаллов концентрации сульфата аммония в ферментноми насьпщающем растворах, а также овлиянии концентрации Фермента и наличия ионов цинка и МПД,П р и м е р 3. 7 мл суспензии обрабатывают, как описано выше. Конечный объем ферментного раствора650 мкл, концентрация белка 13 мг/мл.. К 160 мкл полученного раствора добавляат 40 мкл 4 М раствора сульфата аммония. Конечный объем 200 мкл, концентрация сульфата аммония 20 , концентрация белка 10,4 мг/мл.ферментный раствор в виде капельнаносят на силиконированные стекла,2547как в предыдущих опытах. В чашку Петри помещают 4 мл 4 М сульфата аммонияи 6 мл 0,05 Ы ИЕБ-буфера рН 6,0.5Через две недели в каплях образовываются длинные игольчатые кристаллы, собранные в друзы. Кристаллы мелкие, для дальнейших исследований непригодны.1 О П р и м е р 4, Тот же Ферментныйраствор, что и в предыдущем опыте,наносят в виде капель на стекло, которое помещают в чашку Петри с насыщающим раствором (3,5 мл сульфата 15 аммония и 6,5 мл ИЕБ-буфера), т.е,концентрацию сульфата аммония в насыщающем растворе снижают до 35 .Через четыре недели в раствореобразовываются кристаллы двух видов;20 игольчатые друзы и мелкие ограненныекристаллы в виде гексагональных бипирамид, также не пригодные для исследований.Описанные эксперименты (примеры 3 25 и 4) по кристаллизации карбоксипептидазы Т проводят без добавления ионовцинка и МПД.П р и м е р 5. К 164 мкл ферментного раствора концентрацией 14 мг/мл, ЗО полученного как и в предыдущих опытах, добавляют, мкл: МПД 14; 4 И сульфат аммония (15) 69; раствор 10 И2 пБО 46; 0,05 М МЕБ-буфера (рН 60)167. Конечный объем ферментного раствора 460 мкл, конечная концентрациябелка 0,5 .В качестве насыщающего раствораиспользуют 3,9 мл 4 М сульфата аммония и 6, 1 мл 0,05 М МЕБ-буфера рН д 0 6,0. Через четыре недели в капляхвырастают ограненные кристаллы в виде гексагональных бипирамид, но размер их не превышаег 0,3 х 0,3 х 0,2 мм. Способ получения кристаллов карбоксипептидазы Т характеризующихся пространственной группой Р бр 22 с параметрами ячейки а=Ь=159,4 Л; с=о=106,9 А и углами Ы===90 , заключающийся в том, что из исходной суспензии Фермента в сульфате аммонияотделяют фермент центрифугированием,растворяют его в 0,05 М МЕБ-буферес рН 5,96,2, проводят диализ против этого же буфера и разбавляютраствор до концентрации фермента1,31,5/, к полученному растворуфи ФРРиенщнаао расщба ф"да зцРьlуаюауееф ЧйшЩйепри Уаюау Ююр Солаконираданное саек Составитель И,Привалова актор Н.Гунько Техред М.Дидык Корректор С.ШекмарПодписно Тираж 520Государственногелам изобретенийМосква, Ж, ра аказ б 355/23ВН омитета СССР открытий кая наб., д. полиграфическое предприятие, гУжгород, ул. Проектная, 4 роизводстве 5 1442547 6добавляют водный раствор сернокисло- мента наносят на поверхность силикого цинка до концентрации 13 10М нированного стекла в виде капель и затем 4 М водный раствор сульфата помещают в герметичную камеру с,нааммония до концентрации 103 и 2-ме- сыщающим раствором, содержащим сертил-пентандиол,4 (ИПД) до концент- нокислый цинк, ИЕБ-буфер, ИПД в тех рации ЗХ с достижением при этомже концентрациях и сульфат аммония конечной концентрации фермента 1 в концентрации 33 - 377., процессо 1,2 мас.й, полученный раствор фер- кристаллизации ведут при 5 - 25 С.