Способ определения стероидных гормонов в биологических объектах

,801273334 А 1 33/7 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТЮ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ,; уАВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ 4 т- т Д и4.1.1 Оолон).олярны тостерон, .1,11 стеро остадиен-А -ол-З-он, оидР "оксиметандрост еделяют малополярные и стерокды. Полученный на конечной стадии очистки сухой остаток рас воряют в 963-ном этаноле, добавляю реагент: 96 Х-ном этанол - концентрированкая Н 80 (1 ф 9). Смесь переа 4меаивают, прогревают, охлаждают и добавляют этвнол. Смесь еце перемешивают и измеряют фпюоресценцию при а520 нм,возбуждения480 нм.1 ил, 1 табл.(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СТЕРОЙДН 11 Х ГОРМОНОВ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЬЕКТАХ (57) Изобретение относится к биохимии, в частности к способам определения стероидных гормонов. Цель изобретения - повышение точности, чувствительности, специфичности способа, а также возможность одновременногоопределения в пробе нескольких сти- муляторов роста группы андрогеиов, Образцы тканей .животных гомогениэируют в смесителе с пятикратным объемом 0,14 М раствора МаС 1. Затем в гомогенат добавляют 2,5 объема смеси растворителей: эфир - метиленхлорид (1:1) и встряхивают в течение 1 ч. Зкстракцию повторяют равным объемом экстрагента в течение 30 мин. Органическую фазу переносят в колбу, фипьтруют через безводный Яа 80 и выпаривают на роторном испарителе при 40 С. Концентрированный экстрактрастворяют в хлороформе и наносят наколонку силнкагеля (200 меш): фракция 9 1- 18 мл хлороформа (не содержит исследуемые стероиды),фракция 12 ЗО мл 0,53-ного метанола в хлорофор"ме - содержит малополярные стероиды (метилтестостерон-стеронд1.1.1, 9-нортестостерон - стероид 1. 1.5, трекболон-стероид 1. .6,4 -андростадиенР ол-он-стеро"ид 1.1.7, 17 о -метилА-дигндротестостерон - стероид .1,9), фракция:11 3 - 25 мл 153-ного метанола в хлороформе - содержит полярные стеронды (1.1.8 стероидР -оксиметилте-Изобретение Относится к биохи- . кослойцую хроматографию проводятМИИ В ЧВС 1 ИОСТ 1 К СПОСОбаи ОПРЕ двукратно в системах растворителей:деления стераидных гормонов. хлороформ - этанол - бензол (85:5:15)Цель изобретения - повышение точ" и гексац - дихлорэтанзтилацетатности, чувствительности, специфичнос-(50;20:20), Локализацию стероидовти способа, а также возможность од- устанавливаат облуее пластины вновремеццого определепия н пробе не- УФ-свете и по КГ стандартов. Участскольких стимул 51 торов роста группы ки слон силикагеля, соответствуюандрогенов . щие исследуемым стероидам, снимаСпособ осуцестгляот следуюцим об ют с пластины, переносят в плоскоразом, донные колбочки и элюируют дважды3 - 10 г образца съедобных тканей (по 30 мин) 10 мл 9 б -ного этаноласельскохозяйственных животных (мышц, на 1 яагнитной мешалке, Зтанольныепечени или почек) гомогецизируют растворы после двукратной элюциив смесителе с пятикратным объемом 1 объединяют, выпаривают досуха и ис -0,14 11 раствора 11 аС 1. Гомогеат пе- пользуют для количественного опредереносят в плоскодонную колбу, добав- пения стероидов флюорометрическимЛяОТ 75б". т.ГМСС 1 ГтасгОрЯТЕЛЕЯ: или ГБХ методом,эфи 1-тттд";:;: .:)ртд (1;1) и встрнхи Фракцию 3, полученную после хроваот 1 ч в ат 11),1 е;111 встряхива-29 маторафии.ца колонке силикагеляния, Зк.( тят: т)цт т)1 торяе т рагзым и содержащую полярные стероиды, выобъеисм з; .;тря .цта в теченп 30 миц. паривакт до иинимальцого объема иОргзничдскуто ф 1 эу 1 ПО.Пе 0 Гстаива- наносят ца пльстину Окиси алюмиеияИ 11 т. 1 ЕСИ " , Г,";,:;)Я тт УГ да 1 Отсасенаат (пр 1111 енягот Л 1 0 с фл 1 ооресцентнымЬЯоронскот 1111 т:т,01 с грушей 111 ЛЯ лю индикатором при254 нм плас-ебыь тт 11" пот т 1)о) ттдь тт 1 0" Гтдс)д)1 .тт)11 я тицы 20 х 20 см, то 11 шина слоя 0,5 мм).ж 1 ттк;.)стет 1), ц,-;рено ят 1;15 тту, фиды- ТСХ провод 51 т двукратно в системахруЮТ ЧЕО дэ б .тт-.,11)11 да 80), П 111 арн-, раСТВОрИТЕЛЕЙ: ХЛОрофори - ЭтИЛацЕтваюг ц 1,:тт1: НспаГител:1 при 40 С, тат (1."1) и бензол - зтаиол (9 5:1,КГ),",1.1; 1 гддт);дт ц дтря 11 оас- . яц 10 5) ввор( ттг в ь 1ИтНО ОГ 1 е 1 т ,ттро 11 редлагаемые условия ТСХ на Л 1 Сформа 1.3-5 мц) и наносят на колонку позволяют эффективно разделить исСнт , Кт т" тд 1 1 т) 10 ьтт)1, ) . т; " 1) д труф КГ следуемые пол 5 рцые стероидь. Локалоттк1 т 1 "), 0 с 1 3)ттт 11) 1 тровопЯ 1 ГО лиэацию стероидОН нз пластине Оп01 О)ОСТ)1 О О,)т:Л/)Нц, ":трацц)1 1 - рЕДЕЛЯПОТ И ИХ ЭЛЮДИЮ ПроВОдят КаК18 ИЛ лтор)ф 01 йа - цЕ т:ОцтржИГ И.СЛЕ- ОГиса 110 Для МЗЛОПОЛЯ 1 ЭНЫХ СТЕРОИДОВт 1)мы; С 101)1 тратИ,5 2 - 30 ь;л ,11 аиньгм методом определяют мапоО.т/,.тГОЕГацота т .1:трттт)ЛОМЕ голярцые и полярные стероиды (кроме1) )1с)д 1) т " ь я ттттетп 11 ттд 1 .дтдт тт;е "ф-андростадиен/Д -ОЛ-З-ОИ,тилтестостерол " с1 тд 1 . 1, " 19, КОтОрый следует Определять ГЗЫЯе-кортестос Герон - ста 0;.,д тодом), Полученный ца коцечцой стаТрвтбот 11 " т; От)1 1, 1, б д а"аД, ДИИ ОЧИСТКИ СУХОЙ ОГТЗТОК) СООТВЕТросад)11 "т,т" - О-.т - Г те 1)а 1 ГТ 1 чо 11 й одному из ясследу)1 их. 7 1 ,т,/ "т,ет-";, ")т 1 гтя)т-;т. Ге т);- стероядов) растворяют н 0,3 мл 9 б%-,стерт:и, стра 1 - 11,9)тра 1 ия 3 -ного згацола и добавляют 1,5 мл реа, 25 ил 157,.-)1010 1;етэнола л хлор)сйогт- гецта: 9 б -ный этанол - концентрироМЕСО)ЯЕ 10") 1 ГО)Япт 1 ЫЕ СТЕРОИДЫ ванная серная кислота (1:9). Смесь, тестостерон) т .,1, 11 стсрояд -Ь- 80, охлюкдают ца ледяной бане и-а 1 дрос)ГО 11 ец"-11- 3-011) 1.1 10, Робав 5 я 1 ат 1 мл этанола. Смесь тща"стедропд-б ) - ох си.етацттуосте 11051 с)н), тельно перемешина 1 ат и через 20 минРракто 2 (после хрома Горяфии (выдерживают и темноте при комнатЦа КОтЬ)ЦКЕ 01 Я 111 ЯВГЕ 151) ВЬГППРИВаЮТ В . НОй тЕИПЕРЛТУРЕ) ИЭМЕРЯЮт фЛЮОРЕСвакууме цо минимального объема и ценцию при= 520 нм,г. -, =480 нм.ВРВ)1)тсдаитщ,цацосят ца пластину флорцзила. Лри-ГЖХ (злектг)дтпый захват) метод53меняют флоризиц с флюоресцентным ин- количественного измерения.дикатором гтри= 254 цм (пластины Метод может быть использован для20 х 20 см, толщцяа слоя О,б ии). Тон- количественного измерения малополяр2 ЗЗ"4 зных стероидон, Для получения Фторпроиэнодцых сухой остаток, соотнет" стнующий каждому из исследуемых стероидов, растворяют и 0,5 мл бенэола и добавляют 2-3 капли гептафтормасляного ангидрида. Смесь проогревают 50 мин при 70 и высушивают под струей азота. При фторирова нии от каждого из исследуемых стероидов получают 3- или 17-монофтор производные и 3,17-дигептафторбути .раты. ГЖХ-анализ фторпроизводных стероидов проводят с использование в качестве жидкой фазы ЗХ 07-1 на несенной на хроматон Ю-АУ-ВИСЯ пр меняют стеклянные колонки размером. 1,5 м, температура колонки 200, ис парителя 240, детектора 250 С, газ носитель - азот 40 мл/мин, Типичны результаты БКХ-анализа на примере фторпроиэнодцых Ь 4 -акдростадиен 1,4-1 Р -ол-оц приведены на чертеже ГЖХ (электроцный захнат)-анализ ст роидов позволяет выявить 0,0002 вещества в пробе. Сую 4 арное содержание биологически Образцытканейбычков активных стероидовП р и м е р 1, Опыт проведен наоткормочцых бычках черно-пестройпороды в возрасте одного года, выращенных в условиях промьппленногокомплекса, Животные получали кормвнолю. б 3 питательности рационасоставляли концентрированные корма.и 337. сенаж. 1 инотным подкожно нобласть корня уха имцлацтироналиДо -метил- Ь-ацдростадиецР -"ол-он (метацдростенолои) в дозах130 и 70 мг эа 1 и 2 мес до забоя.После убоя животных проводилигигиенический анализ мяса и субпродуктов с применением предлагаемогометода определения остаточных коли, честв биологически активных стерои"дон андростацоного ряда. Аналогичныеисследования стероидов проводили всыворотке крови испытуемых животных,полученной в разные сроки после имплантации препарата,В биопробах тканей (мясо, печень,жировая ткань) и сыворотки кровивыявлены следующие биологическиаЫ."ивные стероиды:.1 с-метил-анд4ростенф-ол-он 1 Ы-метил-Ы-адростан-ол-он; И-метил- Ь " -андростадиен-бф 17 -диол-он, 1 Ъ.-метил-андростаи-А-од-он. Суммарное их содержание приведено ниже,Печень13,8То же 10,8Печень 7,4То же 2,80 0Мьппцы 0,0То же 4,25,3м3,7О 0Ригк1 р 4 веденцые величины биологически активных стероидов группь ацдро-.генов в продуктах жинотцоводства,полученных в условиях стимуляцииебычков 130 мг метацдростенолона,превышают принятые н нашей стране иза рубежом гигиенические регламентысодержания соединений данной группы,еВместе с тем, при имплантации бычкам метандростенолона в дозе УО мгостаточные количества биологически активных стероидов в продуктах животноводства были существенно ниже,П р и м е р 2. Баранчикам под 30 кожно в область корня уха был имплантнрован меченый препарат в дозе50 мг. Биопробы тканей и биологи"ческих жидкостей были получены через 1,2 и 3 мес после имплантации.рКроме того, поставлен допопцитель.ный эксперимент на собаках по введению меченого метандростенолона.В биопробах от животных (печени,мьппц, слизистой кишечника биологиаб ческих жидкостей) выявлены следующие биологически активные стероидные соединения группы андрогенов;Р1 п-метил-Ь -андростен-ол-он;1 с 1-метил-Ы-андростанр-ол-З-он,3 1 о-метил- Ь-андрастадиец-б,р-диол-з-он, 1 о-метил-б 4-ацдростен. -1 18 1-диол-з-он.Суммарное содержание названныхстероидов в образцах от баранчиков,у стимулированных в течение месяца,составляли в среднеи 13,4 мкг/кг(печень) 4,6 мкг/кг (мьппцы),2,8 мкг/кг (слизистая кишечника),Приведенные величины содержания стеу роидов в печени преньппают допустимыеуровни содержания биологически актив ных андрогенов в продуктах животно водства. Вместе с тем по сраннециюБиопроба Сроки после имплантации р Иь же 5 Не обнаружено же,36 в оч 12с приведенными данными остаточныеколичества стероидов в печени животных, стимулированных в течение 2и 3 мес были соответственно в 1,5 и 2 раза ниже, В ткани мьппц через2-3,мес после имплантации стероидывыявлены не былиП р и м е р 3. Проведены опытына 2 кроликах, которым был имплантирован дандростадиен-ол-он(по 10 мг препарата).Убой животных проводили через20 и 40 дней после имплантации. Исследование остаточных количеств пре.парата проводился в тканях печени,почек, иьппц жире, биологическихжидкостях. В этих опытах исследовано также влияние препарата на гормональный статус животных.В таблице прцведець 1 остаточныеколичества биологически активныхстероидов в съедобных тканях животных.Как показано в таблице, остаточные количества биологически активныхстероидов выявлены лишь через 20дней после имплантации, Через 401дней исследуемые соединения в съедобных тканях обнаружены не были. Уровни тестостерона, прогестерона, 11 --оксикортикостероидов, альдостерона, тироксица, инсулина в сыворотке крови до имплантации и через40 дней после имплантации существенно не отличались. Полученные данные соответствуют гигиеническим требованиям и регламентамформула изобретения Способ определения стероидных гормонов в биологических обьектах, 73334 Ьвклчающий экстракцию и биохимический анализ стимуляторов роста группы ацдрогенов, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повьппения5точности чувствительности и специ)фичности способа, а также одновременного анализа в них метилтестостерона, 19-нортестостерона, тренболона, р,4 -андрцатадиен-ол-З-она,111 З-оксиметилМстостерона, 6-оксиметандростенолона, ь 1 -андростади 1,ен, 17-диол-З-она, 17 с/метило-дигидротестостерона, водный гомогенат биоматериала экстрагируютсмесью эфир, метипенхлорид в соотношении 1;,1, экстракт наносят наколонку силикагеля, промывают хлоро-.формом, далее через колонку пропускают 0,57-цый раствор метанола вхлороформе, и собирают фракцию малополярных стероидов, затем колонкуэлюируют 157;ным раствором метанола в хлороформе н собирают Фракциюполярных стероидов, далее фракцию25 мвлополярйых стероидов разделяют спомощью метода тоцкослойной хроматографии на флоризеле, при этомйдснтифицируют 9-цортестостероц,трецболон, (Р -андростадиен-олЗО -3-он метилтестостерон и 17 о-мутил-о-дигидротестостерон, а фракциюполярных стероидов разделяют метрдом тонкослойной хроматографии наокиси алюминия, при этом идентифицируют 111-оксиметилтестостерон,35б-оксиметандростенолон, А 1-андростадиен,1 ф-диол-З-он, а количественное определение каждого изгормонов проводят флюориметрическиили с помощью метода электроннозахватцой газожидкостной хроматографии,оро тенко ед Составитель А Техред АЛраа кторИ.Кускаирам 77 дарственного и изобретений и %-35, Рауаскав тие г, Уагородэ,1 щеское предоиэводственноЗаказ 6384/17ВНИИПИ Госпо делам113035, Моски онитета СССР ткрытий наб.д. М 5 ектн