Способ получения 3-0 -глукуронпиранозил соясапогенола

СОЮЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК Э(Я 1 С 12 Р ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕН ПАТЕНТУ Н:(54)(57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 3-0 (ф-В-.ГЛУКУРОНПИРАНОЗИЛ )- СОЯСАПОГЕНОЛА Вформулы 6а, Есимаса НакаТакетоси Изаваия)икал К.О. ЛТД отл.ичмикроорганТвырях в питисточникиральные спри рН15 380 Слевого просреды ив соль. ония)) 616.022. 12 (088 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОЧНРЫТИЙ(71) Оцукафармасьют 2 а ю щ и й с я тем, что изм БйаспуЬойгув вр. щтамм ащивавт в .аэробных условнельной среде, содериащейазота и углерода, мине- Я оли и следы микроэлементов,5-11,5 и температуре последующим выделением цедукта из культуральной и необходимости переводят Ф% ВВ1074408 СООН 60 Изобретение относится к химико- Фармацевтической промышленности и касается производства терапевтических средств, которые могут быть использованы в медицине при аутоиммунных и равматических заболеваниях.Предложенный способ новый, .в патентной и научно-.технической литера- турЕ не описан.Целью изобретения является получение 3-0 ф-Р-глукуронпиранозил) - соясапогенола ЖСпособ получения 3-0, (-0-глукуронпиранозил)-саясапогенола В общей Формулы заключается в том, что микроорганизмБгасЬуЬо 1 гув вр, штамм Твыращивают в аэробных условиях в питательной среде, содержащей источники азота и углерода, минеральные соли иследы микроэлементов, при рН 3,511,5 и температуре 15-38 С с последующим выделением целевого продуктаиз культуральиой среды и при необходимости переводят в соль.Штамм БгасЬуЬоггуя зр. Тдляполучения предложенного соединениябыл выделен из почвы в ТоКцяЬ 1 щаС 1 у, То)сцяМща, Уарап.Штамм БСаспуЬоггуя яр. Тхранится в научно-исследовательском институте ферментации Адепсу ог Хп-.йцвгг 1 а 1 Бс 1 епсе апй ТесЬпо 1 оду,дарап (В 8-1 пара Н 1 даяЬ 1 Бсйове,СЬ 1 Ьа-вЬ 1, дарап, под депозитнымномером РБВщ-р 3803, а также в Американском собрании типов культур -12301 Раг 1 1 аюп Ог 1 че ВосЕч 111 е,Магу 1 апй 20852 - пад номером АТСС20513) .Культуральные признаки.Солодовый экстракт агара.Рост быстрый и неравномерный.Субстратный мицелий от рыжевато-коричневого до темно-коричневого. Колония плоская, образование конидийхорошее. Цвет гиф от светло-коричневого до рыжевато-коричневого, наблюдаются капельки жидкости, котораявыделяется. Растворимый пигмент непродуцируется,Картофельная глюкозная ср,даРост очень быстрый и при выращивании при 27 С в течение 30 дней колония достигает размера 70 мм. ПериФерическая часть колонии вытянутадревовидно, наблюдаются прикрепленПолучаютноя ил) - соясаразом.Сначала штамм 81 асйуЬо 1 гув яр, Твыращивают в питательной среде, содержащей обычные источники питания и добавки. В качестве питательного субстрата обычно используются источники азота, например соевая мука, соевое масло, экстракт от замачивания зерновых, дрожжевой экстракт, сухие дрожжи, толокно,3-0 3-Р-глукуронпирапогенол В следующим обмясной экстракт, гидролизованный казвин, соли аммония и нитраты. Подходящими источниками углерода являются глюкоза, глицеролмальтоза, крахмал, лактоза, сахароза и меласса. Добавки к культуральной среде содер жат такие вещества как карбонат кальция, хлорид кальция,сульфат маг. - ния и фосфорную кислот. Если необходимо, то культуральная среда может содерЖать очень маленькие добав ки солей металлов, таких как желе- . зо, медь, магний и цинк. Выращивание проводят в обычной водной среде, содержащей упомянутый субстрат, с, использованием поверхностного или глубинного культивирования с аэрацией и перемешиваиием. Предпочтительно глубинное выращивание с аэрацией и перемешиванием.Культивирование проводят при 15 - 38 ОС, предпочтительно при 20 о32 С,. в течение 3 - 7 дней в условиях обычной аэрации и при поддержании РН культуральной среды 3,5- 11,5, предпочтительно 4;5 - 9,5.По завершении. выращивания полученное вещество выделяют из питатель. ндй среды различными известными методами. Выделение может быть осуществлено, например, методом, использундяим различия в растворимости между продуктами и примесями, или методом, использующим различие в адсорбционной способности и средстве с обычными абсорбентами, такими как активированный уголь ХАДсиликагель, ионообменные смолы, сеФадекс и т.п., или методом, использующим различия в коэффициенте растпэеделения между двумя жидкими Фаза-. ми, и сочетанием таких методов. 40Соединение может быть получено в виде солей с различными Фармацевтически приемлемами основаниями.Соединения могут быти использованы как терапевтические средства 45 при неФритах, В этом случае они могут быть в виде Фармацевтических составов и вместе с обычными фармацевтически приемлемыми носителямиПодходящими носителями р. кОтОрые мо 50 гут быть использованы, являются, на пример, раэбавители или наполнителями, наполнители для увеличения объема, связующие и смачивающие агенты, деэинтеграторы, поверхностно-активные вещества и смазки, которые обычно применяются для приготовления таких лекарств, в зависимости от дозированной Форми.Различное дозированные форьи тв- в 0 рапевтичвских агентов для,лечения нефритов можно выбрать в соответствии с целями лечения. Дозированнымиформамй, которые могут быть использованы, являются таблетки, пилюли,. порошки, жидкие препараты, суспен= зии, эмульсии, гранулы, капсулы, суппозитории и препараты для инъекции (растворы, эмульсии, суспензии и тому подобное) .При приготовлении фармацевтического состава, содержащего соединения согласно изобретению и в качестве активного ингредиента, в форме таблеток может быть использован широкий спектр. носителей, известных в данной области, Подходящими носителями, являются лактоза, белый сахар, хлористый натрий, глюкоза, мочевина, крахмал, углекислый кальций, каолин, кристаллическая целлюлоза, кремииевая кислота, связующие, такие как вода, этанол, пропанол, простой сироп, глюкоза, раствор крахмала, раствор желатина, карбоксиметилцеллюлоза, метилцеллюлоза, Фосфат калия и поливинилпирроллидон, дезинтегра 1 оры, такие как сухой крах-. мал, альгинат натрия, порошок агара, порошок ламинарии, кислый карбонат натрия, карбонат кальция, твин, лаурилсульфат натрия, моноглицерид стеариновой кислоты, крахмал и лактоза, ингибиторы дезинтеграции, такие как белый сахар, глицериловый эфир, стеариновой кислоты, масло какао и гидрогенизированнце масла, промоторы абсорбции, такие как четвертичные основания аммония и лаурилсульфат натрия, увлажнители, такие как глицерин и крахмал, адсорбенты, такие как крахмал, лактоза, каолин, бентонит и кколлиодная кремниевая кислота и смазки, такие как очищенный тальк, соли стеариновой кислоты, порошок борной кислоты, мак-, роголь и твердый полиэтиленгликоль.При прессовании фармацевтического состава В форме пилюли могут быть использованы самые разнообразные обычные известные носители. Подходящими носителями являются.глюкоза, лактоза, крахмал, масло какао, тверденвие растительные масла, каолин, тальк, связующие, такие как порошок аравийской камеди, порошок трагеканта, желатин и этанол и дезинтеграторы, такие как ламинария и агар. Таблетки при желании могут быть покрыты одним, двумя и более слоями например покрытые сахаром таблетки, с желатиновым покрытием, пленочным покрытием и таблетки с покрытием, растворимым в кишечнике. При прессованин Фармацввтического состава в суппозитории могут быть использованы разнообразные носители, известные в технике. Подходящими носителями являются полиэтиленгликоль, масло какао, высшие спирты, эфиРы высших спиртов, желатин н полусинтетические глицериды.1074408 40Испытываемое соеди- нение Острая ток-,сичностьЛЯО мг/кг Антикомплемен тари а яактивность,Более 300 Более 300 500-1000 0,51,0 0,2 0,5 0,1 0,2 Если Фармацевтический состав готовят,в форме препарата для инъекции,то полученный раствор и суспензиюстерилизуют, они должны быть изотоническими, по отношению к крови, Приприготовлении фармацевтического состава в Форме раствора или суспензиимогут быть использованы все известные разбавители, Подходящими разбавителями являются вода, этиловыйспирт, пропиленгликоль, этоксилиРованный изостеариловый спирт, сорбитполиоксиэтилена и эфиры сорбитана.Хлористый натрий, глюкоза или глицерол могут быть введены в терапевтический препарат для лечения нефритав количестве, достаточном для получения изотонического раствораТерапевтический препарат может содержатьвспомогательные средства для растворения, буферы, болеутоляющие агентыи противостарители и что также возможно, красящие агенты, ароматичес кие, вкусовые, освежающие и другиевещества,Количество соединения, вводимогов качестве активного ингредиента вфармацевтический состав препаратадля,лечения нефрита, не лимитируется и может варьироваться в широкихпределах,Подходящим терапевтически эффективным количеством соединения обычно является 1-70 вес,Ъ, предпочтительно 5-50 вес.Ъ от всего состава,Антикомплементарный агент, например при лечении нефрита, в лечебный препарат может вводиться различными путями, приемлемыМи в зависи-.мости от формы лекарственного препарата. Например, таблетки, пиллюли, жидкие препараты, суспензии,эмульсии, гранулы, капсулы вводятчерез рот. Препараты для инъекциивводят внутривенно, либо один, либовместе с вспомогательными агентами,обычными в таких случаях, например 45с глюкозой и аминокислотами. Крометого, если необходимо, лекарственный препарат может быть введен внутримышечно, подкожно, внутрибрюшинно,внутрикожно. Суппозитории вводят интраректально,50Дозу препарата при лечении нефрита выбирают в зависимости от цели лечения, симптоматики и т.п. Обычноприменяют дозу соединения 0,520 мг/кг веса тела в день. 55Соединения обладают антикомплементарной активностью и используются вкачестве лечебных средств при аутоиммунных заболеваниях, болезняхсоллагена и ревматических заболева-60виях.Фармакологические испытания.оИспытываемые соединения,А 3-0- ф-П-глукуронпиранозил)-соясапогенол В. 65 В Глицирризин (соединение для сравне- ния) .Антикомплементарная активность.Антикомплементарную активность определяют следующим образом.В пробирку загружают по 0,5 мл водной дисперсии каждого из испытываемых соединений, по 0,5 мл сенсибилизированных эритроцитов (СЭ), пРи этом культура содержит 1 10 клеток/1 мл пятикратно разбавленного буфериого раствора веронала, содержащего изотонический Желатин (этот пятикратно разбавленный раствор для краткости назван ЖВБ) и по 0,5 мл комплемента сыворотки (комплемент морских свинок), разбавленного 150 раз ЖВБ. Смесь выдерживают при .37 С в течение б 0 мин. Затем к ней добавляют 5 мл ледяного физиологического раствора и центрифугируют. Спектральная поглотительная способность отдельного верхнего слоя определяется при ОП 413, измеряется степень ингибирования гемолиза сенсибизированных эритроцитов испытываемыми соединениями. Значение ингибирующей гемолиз активности (/мл), изме-, ренное описанным методом, показано в табл. 1 для каждого испытываемого соединения.Острая токсичность.Острая токсичность (3 Щомг/кг ве . са) испытываемых соединений была определена на мышах при внутрибрюшинном ввВдении соединения А и при внутривенном введении соединения В.Полученные результаты показаны в табл. 1. П р и м е р 1. В 500 мл колбу Яа ЕудцсМ загружают 100 мл культу- ральной среды и штамм ЯВаспуЬоСтуз зр. Ткультивируют при 25 ОС, рН 5,5 в течение 4 дней при встряхивании. Культуральная .среда содержит,Глицерол1074408 7 750 40 ВНИИПИ Заказ 400/56 Тираж 522 Подписноеее Филиал ППП Патент", г. ужгород, ул.Проектная, 4 Сульфат магния 0,3Соляная кислота 0,0530-литровый. ферментационный сосуд загружают 20 л культуральной среды укаэанного состава и полученную в колбе культуру выращивают в культу- ральной среде при 28 ОС в течение 5 дней при перемешквании со скоростью 300 оборотов,в минуту и скорости аэрации 1 литр на литр культуральной среды в минуту. Полученный куль туральный бульон.центрифугируют со скоростью 8000 оборотов в минуту для . удаления микробных клеток, а рН поверхностного слоя устанавливают равным 1 кОнценгркрованной соляной кис лотой. Полученныепроципитаты собирают центркфугированием к экстрагируют.метанолом,Как видно из табл. 1, значение сотрой токсичности (лдО ) соединения поззоляет применить его в качестве лечебного препарата.Фракцию метанола адсорбируют на колонке с активкрованным углем (500 мл) после ее упаривания при пониженном давлекии., Колонку элюируют водным 30-ным раствором ацетона, а затем водным 50-ным раствором ацетона. Фракцию 50-ного водного раствора ацетона собирают к упаривают досуха в вакууме, Остаток адсорбируют на колонке силккагеля и проявляют смесью хлороформа к ацетона (в объемном отношении 2:1 к 1:1) в качестве родвкжной фазы. С другой стороны фракцию, содер)кащую 3-0 ф-о-глуку роипиранозил)-соясапогенол В", соответствующую фракции, имеющей значение 2=0,38; полученной тонкослойной хроматографией на силикагеле КХеве 1 Уе 1 Г 4 с использованием 40 смеси хлороформа метанола и воды (в объемном отношении 65:35:8) в качестве элюирующего раствора, собирают и концентрируют досуха при пониженном давлении. Концентрат сно ва адсорбируют на колонке скликаге- . ля и элюируют смесью хлороформа с .ацетоном поочередно (в объемных отношениях 22 к 11) и фракцию, соотвЕтствующую описанной, отбирают и концентрируют досуха. Кристаллизацией остатка из смеси хлороформа.с ацетоном (в объемном отношении 1:1) получают 46 мг 3-0 Ц 3-Р-глукуронпкранозил)-соясепогенола В.Т.пл. 231-232 (с разложением) . 55П р и м е р 2. Берут следующие количества, мг: Натриевая соль соединения 500Глюкоза 250Дистиллированная вода для инъекции дообщего объема 5 млНатриевую соль соединения и глюкозу растворяют в дистилированнойводе для инъекций в 5 мл ампулеВоздух заменяют азотом, ампулунагревают при 121 С в течение Ь 5 миндля стерилизации раствора и получают пригодный для инъекций препарат.П р и м е р 3. Берут следующиеколичества, мг:Соединейие согласноизобретениюПолусинтетическое глицеридное основание дляобщего веса 2000Соединение согласно,изобретениюдобавляют к полускнтеткческому осно- .ванию глицеркда, смешивают кх исуспендируют прк 5 ООС. Продукт валквают в форму и оставляют для охлаждения в.естественных условиях,Продукт вынимают и.получают суппозиторий.П р и м е р 4. Верут следующиеколичества, г.Соединение согласноИзобретению 150Авицел (коммерческоеназвание продукта,выпускаемого АваЬА:Казей КцЬавЬЖ 1 Ка 1 вЬа) .Крахмал зерновыхкультур . 30Стеарат магния 2ТС(коммерческоеназвание оксипропилметилцеллюлозы) 10Полиэтиленгликоль ЭКасторовое масло40Метанол 40Соединение согласно изобретению,авицел, крахмал и стеарат магниясмешивают и растворяют в порошок,затем таблеттируют с использованИемобычного сахарного порошка (пудры)для получения покрытия. Полученныетаблетки покрывают составом изТС, полиэтиленгликоля 6000,касторового масла и метанола и получаюттаблетки с пленочным покрытием,