Способ получения клавулановой кислоты и ее солей

(2 йтет Государстееииьщ комит СССР) Опубликовано ЗОЛ 0.79. Б ллетень40 79 ни ования оп опу 72) Автор Иностр Стефен Дж(Великобр Иностр анн Бичам Груп (Великобр обретении окс итани 3 аявител ая фирма Лимитедитания)(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛАВУЛАНОВОЙ КИСЛОТЫ И ЕЕ СОЛЕЙ 2из куль.клаву. ского раамина, а елочного ение Кроме того, перед выдел туральной жидкости экстраг лановую кислоту смесью орг створителя и водонераствори 5 затем водным раствором со металла. Выделение солей клавул осуществляютг 1 утем прону ральной жидкости через см 1 О полиалкиновые или четве вые группы, до насыщения новой кислотой с последую нием соли водным солевым Выделение солей клавул 15 мо о проводить путем пр туральной жидкюсти через у последующей промывкой фи и элюированием ацетатом,Способ осуществляют слеируют аниче мого ли щ ановой кислоты скания культуолу, имеющую ртичноаммониесмолы клавулащим элюирова.раствором.ановой кислоты опускания куль- гольный слой с льтрата водой дующи авулановую кислоту и ее соли полпутем выращивания продуцирующиикроорганизмов рода 51 гер 1 отусательной среде в присутствии истоуглерода, азота и необходимых мьных солей на аэробной поверхностпогружной культуре.качестве продуцента используюЯ 1 г. итопрпепзЬ ХКК 1. 5741, котдепонирован в Беарне (Нидерланды Клчаютее мна лит25 никовнералили в та натофосфата дой при штамО рый о) Изобретение относится к технике получения клавулановой кислоты и ее солей.Известен способ получения клавулановой кислоты и ее солей путем выращивания продуцирующих ее микроорганизмов рода 51 гер 1 отусез на питательной среде в присутствии источников углерода, азота и необходимых минеральных солей с последующим выделением и очисткой целевыхпродуктов 1.Однако чистота получаемых по известному способу продуктов недостаточно, вы. сока.Целью изобретения является повышение чистоты получаемых продуктов,Это достигается тем, что в предлагаемом способе получение клавулановой кислоты и ее солей в качестве продуцента используют штамм 31 гер 1 отусев 1 итоп 11 пепяз МКК 1. 5741.Перед выделением культуральную жидкость юхлаждают, доводят значение рН . до 2 - 4 и экстрагируют из нее клавулановую кислоту сначала органическим растворителем, не смешивающимся с водой, а затем водным раствором бикарбона рия, буферным раствором гидркалия, карбонатом, калия или во нейтральном значении рН.Рост Умеренный Скудный белый Сахар/нитрат агар Скудный бесцветный Белая Глюкоза/аспарагин агар Хороший Умеренный коричневато-серый Скудныйжелтовато-серыйсОбильный желто- вато-серый Светлая коричневато-сераяЪ Глицерин/аснар агин агар Умеренный Скудный белый Бледная желто- вато-коричневая Умеренный желтовато-серыйХороший Скудный серова- то-белый Бледно-желтая Умеренный Бледно. желтая Умеренный бес- цветный Питательный агар Хороший Скудный белый Умеренный желтовато-серыйБледно-желтая Бледно-желтотовато-ко. ричневый Дрожжевой экстракт/солодовый экстракт агар Обильный Обыльный белый до коричневатосерого Обильный желто. нато.серый Неясно. желтая Умеренный Умеренный бес- цветный Овсяно-мучная Бесцветная.18 - ЗT С, Желатину не разжижает при 1 О,18 С. Крахмал не гидролизует. Коагулирует молоко при 25 С 7 дней; при 37 Смолоко не коагулирует.На тирозин-агаровой среде меланьи необразует. 11На пептон-железоагаровой среде не растет,Нитраты не восстанавливает,Отношение к источникам углерода. Данные об усвоении источника углерода на 20агаровой среде приведены ниже (+ усваивает, - не усваивает): ка азота, например, дрожжевой экстракт, кукурузный экстракт; растительный белок,семенной белок, гидролизаты таких бел.ков, гидролизаты молочного белка, рыбные и мясные экстракты и гидролизаты, например, пептоны, Можно использовать также химические испочники азота; мочевину, со- ли аммония; амиды; аминокислоты или их смеси; найример, валин, аспарагин, глута- миновую кислоту, пролин и фенилаланин,В питательную среду можно вводитьуглеводы (0,1 - 5%), Можно также применять крахмал или гидролизаты краймала, напрымер; декстрин, сахарозу, лактозу или другие сахара, или глицерин или его сложные эфиры, Источники углерода могут 5 быть производными растительных маселили жировживотного проксхождения, В качестве источника углерода для роста и получения ингибит 6 ров беталаитамозы можно вводить карбитовые кислоты и их соли.Для регулирэваии пенообразования не "которых сред в ферментерах необходимодобавлять антипенные првсадки, например, Плюроник 1. 81,К среде, описанной выше, можно добавлять минеральные соли, например, хлориЛ-арабиноза +Д-ксилозаД-глюкоза +Д-галаитоза +Д-манноза +Д-фруктозаЛ-рамйоза + .Сахар+ Лак позаЦеллобиозаТрехалозаРаффинозаИнсулинИнозитД-маннит 30 Питательная среда; -которую можноприменять для культивирования 5/герело.тусез /итоп/тепяя, может содержать 0,1 - З 510% комплексного органического источни 3в виде СВЯ 177.76 и в коллекции микроорганизмов ФРГ (ЭЯМ).Морфолопические признаки. При наблюдении в микроскоп серийный мицелий хорошо разветвлен и образует плотно уложенные спирали. Споры находятся в це.- почках по 10 - 50 спор каждая. Споры цилиндрмчоские, размером 0,6 - 0,8 х 1,0 -41,2 мкм, а их поверхность гладкая, Никаких цепочек конидий не замечено, Нет спорангии или жгутиковых спор; спорофоры образованы только на серийном мицелии,Культуральные признаки, В табл, 1 показаны результаты, долученные после культивирования в течение 2 недель при 28 С на различных культурных средах.695565 Табл.ица 2 1.тДиаметр зоны (лл) при продолжительностиферментации, сутки Антибактериальная активность в отношен7 17,4 К 1 еЫе 11 а аегодепез 20,5 26,8 КА 6 37;1 40 0,72 в системе бутанол - уксусная кислота - вода и при Р/ 0,25в системе бутанол - этанол - вода. Величины Р/ оди 7Бакто-декстроза (Дифко) 4,0Растворяют в,дистиллированной воде,доводят до рН 7,3, а затем добавляют20 г/л бакто-агараПроросшие микроорганизмы, взятые спбверхности этого агара, используют непосредственно для инокулирования 100 млпосевной среды, содержащейся в 500 млконических колбах; закрытых пробками изпенопласта. Состав посевной среды, г/л; 10Триптон (оксоид), 5,0.Дрожжевой экстракт 3,0Среду стерилизуют перед онокулированием путем выдерживания в автоклаве поддавлением 1,055 кГ/см 2 при 121 С 15 мин,Микроорганизмы после посева выдерживают в термостате прои 26 С 65 ч на роторном вибраторе при 240 об/мин.Порции по 5 мл посевной среды используют для инокуляции порций по 100 мл 2 фферментативной среды, содержащейся вконических колбах емкостью 500 мл, закрытых пробками из пенопласта.Используют три разные ферментативные среды следующего состава, г/л:А. Глюкоза 20,000Соевая мука 10,000СаСО, 0;200, Ка 2504 0,500СОС 12 РО 46 НзО 0,001Разбавляют дистиллирюванной водой.Б. Декстрин, 55,0Соевая мука, 20,0Мел асса 20,0КаНРО 4 1,3 35КС 1 10 .Разбавляют дистиллйрованной водой,Образцы на четвертый день фермента= " ции наносят в виде пятна на полосу хро матографической бумаги (ватман1) ши; риной 1 см. Эти полосы подвергают хроматографии в течение ночи нри 4 С в следу ющей системе растворителей:н-бутанол в этанол в 4; 1; 5 .(по объему; легкая фаза);4и-бутанол - уксусная кислота - вода12: 3: 5 (по объему),Ленты высушивают и кладут на чашки с агаром, засеянным К/ебыеИа аегодепез КСТС 418 к содержащим пенициллин Ст (пластины КА 6). После выдерживания ча.шек в термостате в течение 16 ч при 28 С просматривают зоны ингибирования роста. В. Дрожжевой экстракт (оксоид) 10Скотазол 20 Разбавляют дистиллированной водой. Доводят значение рН до 7 перед стерилизацией,Все ферментативные среды стерилизуют перед засевом в автоклаве под давлением 1,055 кГ/см 2 при 121 С 15 мин. Колбы для ферментацви выдерживают в термостате при 26 С на роторном вибраторе при 240 об/мин.,Образцы по 5 мл удаляют из ферментационных колб в стерильных условиях на второй день ферментации и обрабатывают следующим образом. Образцы центрифугируют при 2200 Р 10 мин и верхний слой сохраняют. Верхний слой обладает ингибиторной активностью в отношении препарата бета-лактамазы (Е. сой ЗТ 4) с примене. йием стандартной методики определения инпибирования бета-лактамазы.Пример 2, 5/г, /итоп/гпепзгз ХК 1 Ц.5741 выращивают в Среде А, описанной в примере 1. Образцы подвергают через определенные интервалы процессу ферментации в стерильных условиях. Верхний слой получают центрифугированием этих образ. цов при 2200 д за 10 мини подвергают анализу на антибактериальную активность по отнОшению к К/ение//а аегодепез, а с применением диффузии пластинчатого агара с отверстием - и на активность по от. ношению к агаровой системе КАб 111,Результаты анализов приведены в табл, 2. В обеих системах растворителей наблю. дается, одна зона ингибирования при Я/ иаковы с Р/ идентичных клавулановых еислот, прошедыих испытания в такой же системе.П р имер 3, Югер/отусез /итопрпепз/з ХК 1 Ц. 5741 выращивают 7 дней при 26 С на твердом косом агаре, помещенном в бутыли. В качестве агаровой среды используют бакто-дрожжевой агар, содержа. щий солодовый экстракт.В бутыли вводят 100 млстерильной деионизированной воды, содержащей 0,05%5стый натрий, хлористый калий, хлористыймагний, хлористый цинк, хлорное железо,сульфат натрия, сульфат двухвалентногожелеза, сульфат магния, а также натриевыеили калиевые соли фосфорной кислоты; вкачестве источника ионов двухвалентногокальция или для создания буфера можновводить карбонат кальция. Можно такжевключать соли микроэлементов, например,никеля, кобальта или марганца. При желании можно добавлять витамины,ИспоЛьзуемый в данном тексте терминмутант означает любой мутантныйштамм, который повышает спонтанно илибеспрепятственно влияние йаружного средства независимо от того, вводится ли этосредство умышленно или иным образом,Культивирование Югер 1 отусез итопйпепяз обычно проводят при 16 - 35 Сили 25 - 30 С, в частности при 27 С, и рНот 5 до 8,5, предпочтительно от 6 до 7,5.Культивировать можно в сосудах (в стеклянных конических колбах) при перемешивании (при взбалтывании на роторном вибраторе) или в аэрированных ферментерах, например, в ферментерах из нержавеюгдей стали, снабженных перегородками, вкоторых перемешивание осуществляют спомощью лопастных дисковых импеллеров,а аэрирование - с помощью барботеров,Ферментацию можно также осуществлятьнепрерывно.Исходное значение рН процесса ферментации обычносоставляет 7,0, а максимальный выход клавулановой кислоты получают при 20 - 32 С в течение 1 - 10 дней,преимущественно 2 - 5 дней.Перед выделением клавулановой кислоты; и ее.солей из ферментационной средысначала удаляют клетки 51 г, итопйпепйзИК 11. 5741 фильтрованием или центрифугированием.Далее культуральную жидкость охлаждают, например, от 0 до - 5 С, доводятзначение рН до 2 - 3 и экстрагируют из нееклавулановую кислоту сначала органическим растворителем, не смешивающимся сводой, а затем водным раствором бикарбоната натрия, буферным раствором гидрофосфата калия, карбонатом калия или водой при нейтральном значении рН,Клавулановую кислоту из культуральной жидкости можно экстрагировать такйе смесью органического растворителя иводонерастворимого щелочного металла,например, лития,Выделение солей клавуланозой кислотыосуществляют путем использования ионообменной хроматографии на колонках.Культуральную жидкость пропускают через смолу; имеющую полиалкиновые иличетвертичноаммониевые группы, до насыщения смолы клавулановой кислотой с по.следующйм элюированием соли воднымсолевым раствором, особенно с использова материала улучшенного качества. Отделение клавулановой кислоты и/или ее солей от неорганических солей можно также с успехом осуществлять хроматографией на колонке, заполненной средством для фильтрования через гель, например, сшитыми 40 декстрановыми гелями, такими, как Сефадекс 6 15 и полиакриламидными гелями типа Биогель Р 2.1Активный обессоленный материал можно подвергать дальнейшей очистке хроматографией, например, на колонке, заполненной целлюлозой, с применением водно- спиртовой системы растворителей, например, системы бутанол - этанол ввода в объемном соотношении 4: 1: 5 в качестве 45 50 легкой фазы. Клавулановая кислота или ее соль, получаемые при таких реакциях, обладают хорошей степенью чистоты, например, не менее 93%. 55 П р и м е р 1. Югер 1 отусез 1 итопрпепт, %1 Ц. 5741 выращивают в течение 7 дней на твердом косом агаре следующего состава, г/л:Бакто-дрожжевой экстракт(Дифко) 6065 10,0 6нием Изопора, Деацидита РР 1 Р ЯРА 64или ДЕАЕ-целлюлозы,Колонку, заполненную Деацидитом,можно постепенно элюировать водным ра 5 створом соли, например, хлористого натрия (0,5 М) . Колонку с ДЕАЕ-целлюлозой в 0,01 М фосфатном буфере при рН 7можно элюировать раствором хлорида щелочного металла, например, хлористого на 10 трия 0,2 М в 0,01 М фосфатном буфере,Выделение солей клавулановой кислоты проводят также путем пропуска ниякультур альной жидкости через угольнвйслой с последующей промывкой фильтратаводой и элюированием ацетоном.Активные фракции определяют по ихактивности ингибирования бета-лактамазыи по их активности в отношении системыКА 6 ГЦ.Полученные активные фракции соединяют, концентрируют до небольшого объема под вакуумом и обвссоливают.Отделение клавулановой кислоты и/илиее солей от неорганических солей и други.;,25 примесей можно осуществить путем адсорбции антибактериальных средств линофильной смолой, на которой неорганическиесоли не адсорбируются, например, сополимером полистирола с дивинилбензолом тиЗ 0 па Амберлит ХАД.Целевой антибиотик можно удалять изколонки элюированием. Элюирование осуществляют водой или водным алканолом, иполученный раствор концентрируют упариЗ 5 ванием и лиофильной сушкой до получения9тритона Х (поверхностно-активное веще- ство), производят соскоб с поверхностй кулЪтуры и пблучают суспензию опор и мицелия. 100 мл суспензии используют"для посева среды 50 л, содержащейся в ферментере из нержавеющей стали с перего родками общей мощностью 90 л,Применяют посевную среду следующего состава, г/л:Триптом (оксоид) 5,0 Дрожжевой экстракт(оксо ид) 3,0Антипенный агент 0,5Разбавление производйт водопроводной водой,Антипенный агент состоит из 10% Плюроник 1.81 (Южин Кулманн Кемикэлс Лтд.), диспергированного в соевом масле (Бритиш Ойл энд Кэйк Миллс).Перед посевом среду стерилизуют паром в ферментере. После посева продукт перемешивают с применением лопастной дисковой мешалки диаметром 12,7 см, вращающейся со скоростью 240 об/мин, подают стерильный воздух оо скоростью 50 л/мин и поддерживают температуру 26 С-,"Рост посевной культуры продолжается 48 ч.7,5 л полученного продукта используют для засева 150 л ферментативной среды, содерйащейся в ферментере из нержавеюЩей стали емкостью 300 л, имеющем перегородки,На.стадии ферментации применяют среду следующего состава, г/л:Моногидрат глюкозы 20,000 Соевая мука 10,000 СаСО, 0,200 СоС 12 6 Н 20 0,001 На 504 0,500 Антипенный агент 0,500 Разбавляют водопроводной водой.Антипенный агент" исйользуюттакой же, каК всреде для засева.Среду стерилизуют паром в ферментере перед засевом, После засева ферментативную среду перемешивают с применением лопастной дисковой мешалки диаметром 21 см, работающей со скоростью 340 об/мин, вводят стерильный воздух со скоростью 150 л/мин и поддерживают температуру 26 С в течение ферментации, проводймой 72 ч.Цельный отвар осветляют центрифугированием. Осветленный отвар 140 л доводят до рН 6,2, пропускают через сильнооснов.ную анионообменную смолу Церолит РР ЖА 61 (15 х 30 см) со скоростью 500 мл/мин.Колонку промывают охлажденнюй деминерадизованной водой (15 л) со скоростью потока 500 мл/мин, а затем элюируют охлажденным 1 М раствором хлористого натрия с такой же скоростью потока и собирают фракции 4 л. Фракции просматривают 10 с применением нулевого полойейия в мето-дике биоанализа в чашках аистемы КАб.Фракции (2 - 19), показывающие хорошуюактивность на системе КА 6, соединяют, До 6 водят значение рН соединенных фракций до6,2, затем фракции юхлаждают й пропуска-ют через колонку с Амберлитом ХАД(30 х 125 см) со скоростью 500 мл/мин. Колонку промывают охлажденным 1 М раство 1 В ром хлористого натрия(5 л), а затем элюируют деминерализованной водой. при 5 Ссо скоростью 500 мл/мин. Фракции 5 л собирают, начиная непосредственно передполным элюированием хлористого натрия15 из колонки.Фракции 3 - 9, содержащиеклавулановую кислоту, соединяют,Соединенные фракции 35 л концентрируют путем 10-кратного обратимого осмоса.Рециркулируют остаточный продукт из20 емкости, выполненной из нержавеющейстали, снабженной охлаждающей системойс наружным клапаном, ведущим к установке для ультрафильтрования, с получениемразности давлений для 40 1 мембран составляющей 45 атм. Поддерживают температуру 2 - 5 С рН 6,8+0,1 добавлением 2 н,раствора соляной кислоты. Полученныйконцентрат (3,5 л) высушивают с получением бурого аморфного твердого веществаЗВ (34 г).2 г материала, полученного как описановыше, растворяют в 25 мл дистиллированвой воды и наносят на слой размером38 ммх 406 мм пермутитовой смолы РР 1 Рэб (ЬВА 62) в виде хлорида. Колонку элюируют цутем гравитационной подачи 0,5 Мхлористого натрия в амесительный резервуар с 1 л дистиллированной воды, откудаего подают в хроматографическую колон 40 ку. Собирают 10 мл пробы и определяютР-лактамазную ингибиторную активность,используя 1/2500 разбавление фракций. Активность элюируют после основной полосыцвета между фракциями 24 и 30, Акпивные45 фракции смешивают и." концентрируют до30 мл, Этот раствор обессоливают, используя слой - 51 ммх 457 мм из биюрад биогеля,и элюируют 1% и-бутанолом в воде.20 мл фракции исследуют на содержание5 В клавулановой кислоты, используя определение ингибирования Р-лактамазы. Фракциитакже наносят в виде пятен на бумажныеполости и опрыскивают либо реагентомЭрлиха, либо трифенилтетразолевым реагентом, при этом р-лактамазная ингибиторная акпивноеть коррелирует с разовыми илис красными пятнами соответственно, даваемыми этими реагентами. Активные фракциисмешивают, исключая те, которые содержат6 В хлористый натрий, и ионцентрируют под вакуумом, получая частично очищенную натриевую соль клавулановой кислоты,Тонкослойная хроматография (силикагель) этого препарата клавулановой кислоты лает следующие значения Ю и-бута695565 4. Способ по и, 1, отличающийся тем, что выделение солей квавула новой кислоты осуществляют путем пропускания культуральной жидкости через смолу, имеющую полиалкиновые или четвертичноаммо. ниевые группы, до насыщения смолы клавулановой кислотой с последующим элюи. рованием соли водным солевым раствором,5. Способ по п. 1, о т л и ч а ю щи й с я тем; чтб выделение солей клавулановой кислоты проводят путем пропускания культуральной жидкости через угольный слой с последующей про,мывкой фильтрата водой и элюированием ацетатом,Источник информации, принятый во внимание при экспертизе:1. Патент Бельгии827926, кл. С 07 с 1, опублйк. 1974.;а,, Редактор Н. Хубларова Текред А. Камышникова Корректор С. файнЗаказ 1209/1505 Изд." 655 Тираж 549ПодписноеНПО Поиск Государственного комитета СССР по деламизобретений и открытий113035 з Москва, Ж-ЗЬ, Раушская Йаб., д. 4/6Тип, Харьк. фил, пред. ПатентсФ% 111нол- этанол - вода 4 : 1 : 5 (объем/объем) верхняя фаза - 0,37; и-бутанол - уксусная кислота - вода 1 2 : 3 ; 5 (объем/объем) - 0,44; изопропанол - вода 7 ; 3(объем/объем) - 0,78. Зоны выявляют пу- бтем опрыскивания реагентом Эрлиха,6-Аминопенициллановая фракция имеет зйачения Р 0,38, 0,39,и 0,77.Величину Р/ сравнивают с величинойР идентичного бензилклавуланата, хроматографируемого в таких же условиях (реак-тив - хлористый трифенилтетразолий -приготовляют смешиванием 1 ч. 4%-ного.раствора хлористого трифенилтетразолия вметаноле с 1 ч. 1 н, раствора едкой щелочи).Фракции 30 - 45, содержащие бензилклавуланат, соединяют и упаривают припониженном давлении с получением маслянистого остатка."20Продукт, пропущенный через колонку сСефадексом 1.Н 20, растворяю г к"-минимальном количестве смеси циклогексана сэтнлацетатом (1: 1) и "прогфГают" черезколонку (2,5 х 28 см) и оиликагелем, пригодным для тонкослойной хдоматографии,подготовлейную с помощью такого же растворителя. Колойку-элюируют смесью циклогексана с этилацетатом (1: 1) и 28 фракцийобъемом 7 мл собирают с последующим об- з 0разованием фракций по 15 лл. Фракции31 - 33; дающие красное окрашивание при" нанесении на-силикагелевые пластины длятонкослойной хроматографии с последую-щей обработкой реактивом хлористым трифенилтетразолием, соединяют и упаривают при пониженном давлении,Полученное масло подвергают ЯМР- иИК-спектроскопии. Получают спектры,"идентичные полученным для стандартного 40образца бензилклавуланата. "=-=" "Ю6ЕЮ 4 РФЦ ЪЦФормула изобретения1, Способ получения квавулановой кислоты и ее солей путем выращивайия йродуцирующих ее микроорганизмов рода 5/гер/отусез на питательной среде в присутст вии источников углерода, азота и необходимых минеральных солей с последующим выделением и очисткой целевых продуктов, отлич аю щий ся тем, чтьо, с целью по вышения чистоты получаемых продуктов, в качестве продуцента используют штамм Я/гер/отусез /итоп/пепзя ХКК 1. 5741:2. Способ по п, 1; отл ич ающий си тем, что перед выделениеМ культуральную жидкость охлаждают, доводят значение рН до 2 - 3 и экстрагируют из нее клавулановую кислоту сначала органическим растворителем, несмешивающимися с водой, а за тем водным раствором бикарбоната натрия, буферным раствором гидрофосфата калия, карбонатом калия или водой при нейтральном значении рН.3. Способ по п, 1, отлич а ющийся тем, что перед выделением из, культуральной жидкости экстрагируют клавулановую кислоту смесью органического растворите. ля и водбнерастворимого амина, а затем водным раствором соли щелочного металла.