Модифицированный полимерами макропористый кремнезем в качестве носителя для дисульфидно-обменной ковалентной хроматографии белков и способ его получения

ОПИСАНИЕИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ Союз Советских Социалистических республик(22) Заявлено 2401,77 (21) 2444832/23-05с присоединением заявки Йо(51)М, Кл,2 С 08 Р 8/32 Государственный комитет СССР по делам изобретений и открытиИ(72) Авторы изобретения 71) 3 аяВИтЕлЬ рдена Ленина институт элементоорганических(54) МОДИФИЦИРОВАННЫЙ ПОЛИМЕРАМИ МАКРОПОРИСТЫЙКРЕМНЕЗЕМ В КАЧЕСТВЕ НОСИТЕЛЯДЛЯ ДИСУЛЬФИДНООБМЕННОЙ КОВАЛЕНТНОЙХРОМАТОГРАФИИ БЕЛКОВ И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ матографии белков на основе модифицированного полимерами макропористогскремнезема и его производных обшейформулы Изобретение относится к сорбентам, применяемым для выделения и очистки белков, а именно к носителю для дисульфиднообменной ковалентной хро 4 сн - сн-,+ -сн - сн 3-р с с с с О Н О О Х О Ф" %, ф, Гвщ -О- СН Известен модифицированный макропористый кремнезем, имеющий на повености группы гмнезем с диаметобъемом пор 1,7 ой поверхностьюильного моноуппы, состояща, стирола,эФира,мера, ей иэ этиле" -О 25 ния так но гра- хима ффекк дз сульфиднообменная ков тография - недавно раз для тонкой очистки бел изации Ферментов. ентнаяботанный ов и имо метмо 6-макропористый копор 1100-1160 А,1,8 смф/г, удель30-40 м в/г,где М - звено вивыбранного из грБ-винилпирролидои винилэтиловогои способу полтели. и способ егоИзвестныйнообменнойФии на основмически макр.обладает недтивной емкос получе носите овален модиф порист статоч ью по ль для дисул ной хромато цированного го кремнезе о высокой э активньи687081 группам (до 40 мкмолей на 1 г твердой фазы), а также некоторой (до 4-5 мг на 1 г твердой фазы) неспецифической сорбцией по белку, 5 что заставляет использовать буферные растворы с высокой концентрацией солей и хаотропных агентов, затруд-. няющих дальнейшую очистку белков.Известный модифицированный макро- пористый кремнезем, получают обработкой В -аминопропилированного макропористого кремнезема 1-оксо- -этокси-тиолан-ионом с последующим действием 2,2 -дипиридилди сульфидом, Однако этим способом получить производные макропористого кремнезема укаэанной общей формулы невозможно. Предлагаемый же способ позволяет решить эту задачу. 20Цель изобретения - получение носителей для дисульфиднообменной ковалентной хроматографии с повышенУ-кратный изВытак СН СН Н - СН- СН-й - СН - СН-М- г г г г+С С С СГФъ,О О О О О О 7 акрап диамет ристыи кремнезем;пар ПРО - ИбО А,7 - И смз/г,паВерхнастьд мг/г обьему 0 ельна50 -СН- СН - М.3 СН - СН -С СфО БР-кратный издь так 2 М - СНг-СН,-%гс де М - звено винильного мономера, ыбранного из группы, состоящей из Мсульфидному обмену -ной емкост ью по акти вным к дисул ьФидному обмену группам и пониженной неспецифической сорбцией по белку.В соответствии с предлагаемым изобретением носители укаэанной общей Формулы получают ковалентным присоединением к поверхности макропористого кремнезема, модифицированного -аминопропилтриэтоксисиланом, сополимера малеинового ангидрида с вин иль ныл мономером с последующим введением тиольных групп и дальнейшей обработкой полученного материала дипиридилдисульфидом. Предложенный способ отличается тем, что введение тиольных групп осуществляют путем обработки-аминопропилированного макропористого кремнезема 3-15-кратным избытком сополимера малеинового ангидрида с винильным мономером и затем 5-20-кратным избытком 2-меркаптоэтиламином или его,солью в присутствии основания . лпирролидона, стирола, этилеинилэтилового эфира; соотно 687081Венке ли; п; р - 1;2-10;1. Продуктиспользуют в качестве носителя дксульфиднообменной ковалентной хроматографии белков.В примерах описывается получениеи использование новых носителей длядисульфиднообменной ковалентнойхроматографии белков,П р и м е р 1, Получение носителямодификацией макропористого кремнеземасополимером малеинового ангидрида и 10М-винилпирролидона (соотношение ангидридных звеньев полимера и ам .ногруппносителя 3:1) .3,0 г (1,23 ммоля аминогрупп)аминоалкилированного макропористогокремнезема прибавляют, к раствору0,77 г (3,69 ммоля ангидридныхзвеньев) сополкмера малеинового ангидрида и винилпирролидона (соот -ношение мономеров 1:1; мол,вес. 60007000) в б мл сухого диметклформамидаи перемешивают реакционную массу 3 чпри 50-60 СЖидкую Фазу отделяютдекантацией и промывают носительдиметилформамидом до тех пор, покапоказатели преломления чистого растворителя и промывок не станут одинаковыми, Затем носитель промывают ацетоном(Зх 20 мл), эфиром (Зх 20 мл) и сушатв вакУУме над Р 20 . Кислотно-основноетитровачие ангкдрйдных звеньев, привитых к твердой фазе, дает 0,14 ммоля на 1 г твердой фазы, ЙК в спекмодифицированного носителя (таблеткаизмельченного в порошок вещества вКВч) показывает появление по сравнению З 5с аминоалкилированным кремнеземомполос при 1860 и 1780 см , свойственных насыщенным ангидридам с пятичленным циклом.3,0 г полученного материала суспендируют в 8 мл раствора 2,8 г гидротартрата 2-меркаптоэтиламина в пиридине и перемешивают 3 ч при комнатнойтемпературе, Далее носитель промываютпиридином (Зх 20 мл), 0,1 н. )(С 6-дипиридилдисульфида в диметилформами.де, Перемешивают 6 ч при комнатнойтемпературе, Жидкую фазу отделяютдекантацией, а носитель промываютдиметилформамидом (5 х 20 мл), абсолютнымспиртом (5 х 20 мл) и сушат в вакуумоксикаторе над ИаОЛ. Количествоактивных к дисульфидному обменугрупп, определенное спектрофотометркрованием выделившегося при исчерпывакщем восстановлении навески носителя2-тиопиридона, составляет 80 мкмолей 60М-а Яы,Я) гРупп на 1 г твердой Фазы,Р 2, Получение носителямодификацией макропористого кремнеэе ма сополил",гром малеиновогэ ангид) и; и и (з 1-винклпирролидона соотношение ангидридных звеньев полимера и амкногрупп носителя 15:1) .3,0 г (1,23 ммоля амииогрупп) аминоалкилированного макропоркстсго кремнезема прибавляют и раствор 3,85 г (18,45 ммоля ангидридных звеньев) сополимера малеинового ан - гидрида и М-винклпкрролидона (соотношение мономеров 1:1 у мол,вес, 8000-10000) в 15 мл сухого пиметилФормамида и перемешивают реакционную массу 3 ч прк 50-60 С, Далее носи - тель пролывают так же, как в примере 1 й к сушат в вакууме над Р Г),. Кислотно-основное титрование ангидридных звеньев, привитык к твердой фазе, дает 0,18 ммоля на 1 г твердой Фазы, ИК-спектр полученного продукта содержит полосы при 1860 и 1790 см , свойственные насыщенным ангидридам с пятичленным цкклом, Затем 3,0 г полученного вещества обрабатывают как в примере 1, но гидротартрат 2-меркаптоэткламина вводят в реакцию в количестве 14,0 г, а 2,2-дипиридилдксульфид н количестве 3,0 г. Емкость полученногоМносителя 110 мкмолей й групп- 3 - Б )на 1 г твердой Фазы,П р и м е р 3, Получение носителямодификацией макропоркстого кремнезема ссполимером малеинового ангидрида и стиролаЗ,О г (1,23 ламоля аминогрупп)аминоалкилкрованного макропористогокремнезема прибавляют к раствору0,75 г (3,69 лмоля ангкгридных,звеньев) сополимера малеинового ангидрида со сткролом (соотношениемономеров 1:1,5; мол,вес, 700011000) в диметилформа.ниде и перемешивают 3 ч прк 60-70 С, Далее носитель промывают как в гримере 1 исушат над Р 0, Кислотно-основноетитрование ангидридных звеньев, привитых к твердой Фазе, дает 0,21 ммоля на 1 г твердой Фазы. ГК-спектрполученного продукта содержит полосыпри 1860 и 1790 см ", свойственныенасыщенным ангидридам с пятичленнымциклсл:, Далее 3,0 г полученноговещества суспендируют в 8 ил раствора1,0 г 2-меркаптоэткламина в диметилФооламкде и перемешивают 3 ч при комнатной температуре, Затем носительпромывают диметклформамидом (Зх 20 мл),спиртом (Зх 20 мл), дистиллированнойводой (Зх 20 мл), буферным раствором;0,1 М трис/ЯС 0 - 1 ммоль ЭДА,рЛ 8,0 (Зх 10 мл) к суспендируют в5 мл укаэанного буфера. К суспензиидобавляют 5 мл раствора 1,2 г 2,2-дкпиридилдисульфкда в диметил",ормамиде и перемешивают реакционнуюмассу 6 ч при комнатной температуре Жидкую Фазу отделяют декантацией, а носитель промывают реакционным растворителем (100 мл), водой (200 мл) спиртом (100 мл) и сушат целевой продукт в вакуум-эксикаторе над МаОЛ. Емкость полученного ноМсителя 150 мкмолейгрупп на 1 г твердой фазы. 10П р и м е р 4, Получение носителя модификацией макропористого кремнезема сополимером малеинового ангидрида с винилэтиловым эфиром,3,0 г (1,23 ммоля аминогрупп) аминоалкилированного макропористого кремнезема суспендируют в 6 мл раствора 2,8 г сополимера малеинового ангидрида (6,15 ммолей ангидридных звеньев) с винилэтиловым эфиром (соотношение мономеров 1:5; мол,вес, 8000-12000) в диметилформамиде и перемешивают 3 ч при 50-60 С, Далее носитель промывают как в приОере 1 и сушат над Р О , Кислотно- основное титрование ангидридных25 звеньев, привитых к твердой фазе1 дает 0,19 ммолей на 1 г твердой фазы. ИК-спектр полученного продукта Содержит полосы при 1860 и 1790 смсвой ств ен ные насыщен ным ан гидридам с пятичленным циклом, Далее носитель обрабатывают как в примере 1, но гидротартрат 2-меркаптоэтиламина вводят в реакцию в количестве 4,67 г,а 2,2-дипиридилдисульфид35 в количестве 1,0 г, Емкость полученного носителя 120 мкмолейХ- - 3 групп на 1 г твердойфазы,П р и м е р 5. Получение носителя модификацией макропористого кремнезема сополимером малеинового ангидрида с этиленом.3,0 г (1,23 ммоля аминогрупп)аминоалкилированного макропористогокремнезема суспендируют в 10 млраствора, 1,24 г (12,3 ммоля ангидридных звеньев) сополимера малеинового ангидрида с этиленом(соотношение мономеров 1:3; мол,вес. 1600-20000) в диметилформамидеи перемешивают 4 ч пии 60-70 С,Далее носитель промывают как в примере 1 и сушат в вакууме над Р О, .й ГКислотно-основное титрование ангидридкых звеньев, привитых к твердойФазе, дает 0,24 ммоля на 1 г твердой Фазы, ИК-спектр полученногопродукта содержит полосы при 1860и 1790 см "., свойственные насыщеннымангидридам с пятичленным циклом,Затем носитель обрабатывают как в йримере 1, но гидротартрат 2-меркаптоэтиламина вводят в реакцию в количестве 9,34 г, а 2,2 -дипиридилдисульфид в количестве 2,0 г, Емкость полученного носителя 190 мкмолейЯ-Ьгрупп на 1 г твердой фазы,П р и м е р 6. Выделение меркаптоальбумина из препарата бычьего сывороточного альбумина дисульфиднообменной ковалентной хроматографии.200 мг бычьего сывороточного альбумина ( Са 1 ЫоспещСША; ЯЛ- -титр 0,59 + 0,02 моля 5 Л-групп на 1 моль препарата белка) растворяют в 10 мл буфера 0,1 М Трис/НС 1 0,3 КС 6 - 1 ммоль ЭДТА, рЛ 7,9 и вводят в контакт с носителем для дисульфиднообменной ковалентной хроматографии, получение которого описанс в примере 1, причем носитель берут в количестве, соответствующем не менее чем 100-кратному избыткуЫ-3- групп носителя к числу 3 Н-групп белка. Суспензию перемешивают 6 ч при комнатной температуре, твердую фазу отделяют декантацией и промывают последовательно тем же буферсм (Зх 30 мл),1,5 М КСР (Зх 30 мл 1 деионизованной водой (Зх 30 мя), и окончательно исходным буфером (50 мл) . Далее носитель с иммобилизованным меркаптоальбумином переносят в хроматографическую колонку и смывают белок элюцией линейным градиент.ы от 0 до 0,1 М концентрации цистеина в исходном буфере. Фракции, содержащие белок, объединяют и подвергают обессоливанию на колонке с сефадекссм Г,; а затем высушивают целевой продукт лиофильно. 5 Н-титр полученного белка: 1,00 + 0,02 мс .,"; 5 Л-групп на 1 моль альбумина. Изоэлектрофокусирование этого продукта на колонке в градиенте плотности сахарозы в борно-боратном буфере с линейным градиентом концентрации маннита показывает наличие одной фракции с изоэлектрической точкой 5,30, в то время как исходный препарат белка содержит 4 Фракции с изоэлектрическими точками: 4,86; 4,98;5,14 у 5,30. Результаты экспер ментов по выделению меркаптоальбумина из препарата бычьего сывороточного альбумина с помощью носителей для дисульфиднообменной ковалентной хроматографии, получение которых описано в примерах 2-5, приведены в таблице,687081 буфере (20 -меркаптаэ при комнат твердую Фа еспеифиескаяарбхал ер т ее рабаильтратодвергают апоия,г дел ьдиализом,веществ пе(79%),ка ас тел чи для выделенияике суммарныхекарских дрожжейй, получение коимерах 2-5, лолуезультаты, Лербции белков неак применяют будержаший детерген 90,1 0,8 81,5 0,8 20 5 7 73 3 83,0 1,1 4 1,ывароточный ал 7, Выделение пекарских дражжбы Уся н- аэ п рдходи ом дмешин аю6 ч,промывмл) и су груп в ис пере туре Фазу (100 Суспензию темпера-, твердую буферам том еже езинтеграте,и комнатно отдел яю ают ее рабоч сп енди руют в+По номеру примера, где описанполучение соответствующего носителя;.П р и м е р суммарного белка ейдисульфиднаобменной ковалентнойхроматографией,Пекарские дрожжи эаморажинают вдистиллированной воде и дезинтегрируют н процессе Хьюса, Дезинтегратоттаивают, суспензию центрифугируютпри 5000 об/мин, суперматант отбирают и лиофилизуют.1,0 г лиафилизованнаго суспернатанта (содержание общего белка по данничбиуретовой реакции 0,404 г) растворяют в 30 мл рабочего буфера:0,1 М Ма-фасфат - 0,15 М йа-додецилсульфат - 1 ммоль ЭДТА, рЛ 7,8, Раствор 15 мин продувают аргоном,добавляядля гашения пены 3-5 капель этанола,затем вносят 1,0 мл 2-меркаптоэтанола и инкубируют смесь 2 ч прикомнатной температуре, Далее отделяют низкомолекулярные вещестна наколонке с сефадексом Г, уравновешенным рабочим буфером, а Фракциюэлюата, содержащую высокомолекулярные вещества, вводят в контакт сносителем для дисульфидноабменнойковалентной хроматографии, получениекоторого описано в примере 1, причем носитель берут в количестне Исчета 1 мкмоль дтве ой фазы на 1 мг елка мл) (одержащем 1 мл тавола . Перемсшинагт 4 ч най температуре, о.делает зу декантацией, прел,на - чнм буферам (100 мл), а и промывки объединяют и абессоливанию электро- Выход суммарных белковых карских дрожжей 0,3 г При исгальзаванпа описанной метабелковых веществ пс помощью носителетарых описано в прчают аналогичные рспецифическойсонаблюдается, так кФерный раствор, саКа-додецилсульфат.П р и м е р 8. Регенерация носителей после испольэонания в процесс дисульфидноабменной кавалентной хра матаграфии.3,0 г носителя (любага из описанных в примерах 1-5) после использования в хроматографическом процессе суспендируют в 20 мл буФера: 0,1 М Трис/ЛСЮ - 0,2 М Ма-додецилсульфат - 1 ммаль ЭДТА, рЛ7,8, Добавляют 2 мл 2-меркаптаэтанола и перемешивают б ч при комнатнойтемпературе, Твердую фазу отделяютдекантацией, промывают буфером(4 х 50 мл), спиртом (Зх 20 мл), диметилформамидом (Зх 20 мл), а затем обрабатывают 2,2-дипиридилдисульфи 1дом согласно методике примера 1,П р и м е р 9. Регенерация изтка 2,2-дипиридилдисульфида после активации . 5 г 1-носителейраствор, содержащий иэ быт очный 2 2, 2-дипиридилдисульфид и выделивший в результате реакции актинадации 5 Л-групп носителя (см, примеры 1-5 и 8) 2-тиопиридон, отделяют ат твердой фазы и упаринают в вакууме досуха. Остаток растворяют во 15 мл метанола, охлаждают до 0 С и при перемешивании прибавляют па каплям 30-ный водный раствор перекиси водорода до полного абесцнеч вания реакционной массы, Перемешин ние продолжают на холоду еще 30 мин, а затем выливают раствор в 300 мл ледяной воды, при этом выпадает белый осадок, который отфильтровывают, промывают на фильтре 100 мл ледяной воды и сушат в вакуум-эксикаторе над НаОН. Продукт перекристаллизавывают из гексана; т.пл, 57-58 С (лит,т.пл, 58 С),Полученные согласно предлагаемомуобретению носители сохраняют нселожительные свойства носителей на неорганической основе, нключая ме(менее 1-2 мг на 1 г твердой Фазы),Это дает возможность использоватьйолученные носители длявыделенияи очистки индивидуальных белков, Ферментов и белковых комплексов с боль 5 шей по сравнению с прототипом эффективностью,Формула изобретения 101, Модифицированный полимерамимакропористый кремнезем общей форму- лы В - СН 1- СНУ - СН СНг - СН, - З - 8О Н О О Б ОГФ / ФС С С С+ СН - СН 3 -Мя+СН - СН 3 р где п: п: р:2 - 10:1;В - макропористый кремнезем с диаметром пор 1100-1160 А , объемом пор 1,7-1,8 см/г, удельнойповерхностью 30-40 м/г;М - остаток мономера - И-винилпирролидона, стирола, этилена, винилэтилового эфира, 30в качестве носителя для дисульфидиообменной ковалентной хроматографии белков.2, Способ получения соединения по п.1, путем введения на у-амино пропилированный макропористый кремнезем тиольных групп и дальнейшей активации этих групп дипиридилдисульфидом, о т л и ч а ю щ и й с я Составитель А.ПереверзеваРедактор Т.Загребельная Техред Л.АлфероваКорректоГ Е.Папп Заказ 5995/55 Тираж 585 Подписное ЦЛИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д, 4/5Филиал ППП Патент , г,ужгород, ул.Проектная,4 ханическую прочность, устойчивостьк в оздейств ию микроорганизмов,постоянство объема в различных жидкихсредах, и, кроме того, обладаютповышенной емкостью по активным кдисульфидному обмену группам, которая достигает 150-190 мкмолей на1 г твердой фазы, что в 3-5 разпревышает максимальную емкость прототипа. Предложенные носители имеютв 2-3 раза меньшую по сравнению спрототипом неспецифическую сорбциюпо белку в процессе дисульфиднообменной ковалентной хроматографии тем, что, с целью повышения емкости носителя по активным к дисульфидному обмену группам и снижения неспецифической сорбции белков, введение тиольных групп осуществляют. путем обработки .) -аминопропилированного макропористого кремнезема 3-15-кратным избытком сополимера малеинозого ангидрида с винильным мойомером, а затем 5-20-кратным избытком 2- -меркаптоэтиламином или его солью в присутствии основания.Источники информации, принятые во внимание при экспертизе1. Авторское свидетельство СССР р 540870, кл, С 07 Р 7/18, 1975 (прототип) .