825626

Союз СоветскикСоциалистическикРеспублик ОП ИСАНИЕИЗОБРЕТЕН ИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ и 825626(72) Авторы изобретения П. И, Гвоздяк и Н. Ф, Могилевичс; Институт коллоидной химии и химии воды АН Украинской ССР( 54) СПОСОБ ДЕЗИНТЕГРАЦИИ МИКРООРГАНИЗМОВ Изобретение относится к микроуаологии и может быть использовано в исследовательской работе микробиологической, пишевой и медицинской промышленностях для разрушения клеток и получения из них белка, нуклеиновых кислот, антигенов и дру 5 гих ценных биологически активных веществ,Известны способы дезинтеграции микроорганизмов (баллистические, экструзионные), предусматривающие экструдированиетосуспензий клеток, а также различные типыпомола или дробления клеток микроорганизмов: химические, при которых биомасса микроорганизмов, подвергается обра 15ботке химическими реагентами, например,кислотами, щелочами, солями, детергента.ми, антибиотиками, сжиженными газамибиологические, предусматривающие лизискультур микроорганизмов под воздействием ферментных препаратов, фагов, внутриклеточных паразитов и т,д., и физические,при которых клетки микроорганизмов подвергаются высушиванию, регидратации. 2сильным и сверхсильным воздействиям, способным вызвать гидродинамические градиенты (обработка ультразвуком, газодекомпрессия)1, а также электровоздействие 21Недостаток известных способов - отсутствие универсальности,Наиболее близок к предлагаемому потехнической сущности и достигаемому эффекту способ дезинтеграции микроорганизмов, предусматривающий приготовление суспензии микроорганизмов и ее обработкуэлектрическим полем. Способ предусматривает погружение электродов во взвеськультуры и осуществление электрическихразрядов, Мощность таких разрядов достаточно высока до 1000 Ък, а используемое напряжение электрического поля наэлектродах составляет 30000-40000 В.При высоковольтном электроразряде возникает целый ряд явлений, обьединенныхпод общим понятием электрогидравличский эффект, а именно, ра:рядная плазма,мощные ударные волин, наруа.ние пелост 3 МММ4мости жидкости, высокая ионизация, уды- ц табл. 2 приведено влияние напряженразвуковые излучения и др, Элекгрогид- ности электрического поля на выход белкаравпический эффект оказывает сильное раз- при дезинтеграции,рушающее действие на клетки микроорга- Влияние вре)(ени воздействия неоднороднизмов 3ного электрического поля постоянного гьНедостатком способа является спож- ка на выход белка при дезинтеграции по.ность проведения процесса дезинтеграции йзвно в табл, 3,кпеток, обусловленная испопьэованием вы- Из табл. 1 видно, что наиболее бласоковопьтного электрического попя, а так- гоприятные условия дпя разрушения микже то, что для проведения дезинтегра О робных клеток создаются при ис 9 опьзовации необходима соответствующая аппара- нии .анионобменной смолы АВ, В этотура (высоковопьтные масляные трансфор- случае отмечен максимальный выход белматоры, конденсаторы значительной емко ка, значение рН водного раствора которо,сти, зарядные сопротивления и т.д.), го бпиэко к нейтральному (рН 6,55).Цель изобретения - упрощение процес-Нри. использовании смеси ионобменныхса дезинтеграции микроорганизмов. смол, содержащих различное весовое соот;Поставленная цепь достигается обработ- ношение анионобменной смолы АВикой суспензии микроорганизмов в эдектри- катионобменной смолы КУ, наблюдаетсяческом попе в присутствии анионобменных практически одииаковый выход белка вили катионобменных смол или их смесей. о пределах 0,6-0,65 оптических ед, ЗначеПри этом обработку проводят электри- ние рН растворов белка равно,5,5-6,0,ческим полем постоянного йди переменно- Такое же количество белка получается приго тока напряженностью 10-75 В/см, использовании катионобменной смолы КУ,предпочтительно 25-30 В/см, а в случае Однако значение рН раствора белка в этомиспользования смеси анионобменных и ка случае смещено в кислую сторону (рНтионобменных смод последние берут в со 4,7), Это следует иметь в вИду при деотношении ог 4:1 до 1:4. струкции микроорганизМов и полученииП р и м е р 1. 2 г сырых.дрожжей белка, оптимум рН работы которого лежитассЪсповсев сь ейеае суспенди- в хисдой среде.руют в 5 мл дистиллированной воды вмес- Данные табл, 2 показыв ., то наибоЗОте с 8 г смеси ионобменных смол АВлее оптимальным условием дезинтеграциии КУв весовом соотношении 1;1, поме- микроорганизмов явля".гся напряженностьщают в электрическое подепостоянногб.х электрического поля 25-50 В/см, так кактока напряженностью 25 В/см. Эпектр"снижение напряженности приводит к ухудотделены от реакционной массы токопръ- шению дезинтеграции и меныфему выходуводящими пластинами. Через 5 мин эдекг-белка, а увеличение сопровождается снирическое попе отключают, деэинтеграг от- жением рН, атакже может наблюдатьсядедяют от ионобменных смол, а последние повышение температуры, что приводит кдопопнитепьно промывают 5 мд Фисгипди- инактивации ферментов,рованной воды, К подученному об%ему деэ- Из табл. 3 следует, что достаточноеинтеграта добавипог 10 мп 1/15 М фос- время обработки суспензии микроорганиз 4 Сфатного буфера рН 7,2 и ценгрифугируюг мов составляет 5 мин.В сунернатанте" с помощью ульграфиодето П р и м е р 2, В 15 мл суспензиивого спекгрофотомегра Бресогб ОЧ-ъяя бактерий басИов 80(ВИв З/Ъустанавливают наличие белка и нукдеино а тивного деструктора гексаметипендиамивых кислот, . на (ГМИ), содержащей 100 млрд клетокЛДЯ о РедедениЯ опти ж РежимЫ в 1, д,баю, 8 г смеси и,бменныхобРаботки сУспензди микРооРганизмов эле- смод АР 17 и КУв,соотношени 1:1 иктрическим подем изучают влияние сосга- помещают в эдектрическое поле постоянва ионобменных смол, напряженности эле- мого тока напряженностью 25 В/см. Послекгрического подя (табд. 2) и времени воэ 50 5 мин выдержки в электрическом поле дедействия электрического поля (габп,З) на зинтеграт отделяют ог ионобменных смол.степень разрушения микробных клеток и К полученному дезинтеграту добавдяюгвыход бедка, фосфагный буфер рН 7,2, центрифугируюг30:мин при 6000 об/мин и в надосадочВпияние соотношения ионобменных смоп . н(ой жидкости усганавдивают наличие бедна содержание и рН белка, подученных при ай на ультрафиолетовом спектрофотометредезинтеграции ВойсдгощзСЕ свтчВЧцв бреоогй ОМ-Чф, В супернатантепредставлено в табл, 1, содержащем белок, обнаруживают фер828626 электрическое поле отключают, дезинтеграт отделяют от ионобменных смол и центрифугируют. Осадок проверяют с помощьюмикроскопа на степень .дезинтеграции, анадосадочную жидкость - на наличие бел ка и нуклеиновых кислот с помощью ультрафиолетового спектрофотометра 5 ресогбЦЧ - ЧХЬ.Как видно из приведенных данных, пред 4,лагаемый способ дезинтеграции значительно упрощает процесс разрушения микроорганизмов, так как предусматривает использование электрического поля низкой напряженности (порядка 25-50 В/см), что примерно в 1000 раз меньше, чем в известном способе.В предлагаемом способе исключае".сянеобходимость использования специального высоковольтного оборудования, при от-делении. электродов от реакционной смеситокопроводящими пластинами сводитсяк минимуму вероятность протекания механо-химических реакций между веществами и газами, образующимися на электродах, в дезинтеграторах,Таблица 1 АВ:КУ,весовое сорН волн,ого дезинтегратарН раствора белка после добавления фосфорного буфера Содержание белкав супернатанте ед,оптической плотности отношение 1:0 6,55 7,2 4:1 5,9 0,65 7,2 2:1 5,7 7,2 0,620,62 .0,580,560,580,58 1,5-1 5,65 7,15 7,15 7,15 1:1,5 1:2 7,15 1:4 5,4 7,15 0,62 4,7 7,15 П р и м е ч а н и е: Е=25 В/см; 1 =5 мин. Таблица 2 рН водного дезинтеграта . Напряженность, В/см 10 0,4 5,9 0,64 0,69 50 4,85 0,7 П р и м е ч а н и е: АВ: КУ=1: 1;=5 мин,ментативную активность в отношении ГМЙ к 1 мл раствора белка, добавляют 1 мл ГМЙ в концентрации 1 г/л и инкубируют б,мин при 32 С, По истечении периода ийкубации определяют остаточ ную концентрацию ГМД в пробе с помощью реакции с 2,4-динитрохларбензолом, Опыты показывают, что после 5 мин контакта белка с ГМ 1, последний полностью отсутствует в реакционной смеси или обна 10 руживается в виде следов, Наличие активности белка в отношении ГМИ свидетельствует о разрушении исследуемых клеток,Фтак как известно, что гексаметилендиамин - гидролизующий фермент находится внутри клеток и не выделяется в среду.П р и м е р, ЗР 2 г сырых дрожжей ЗоссФа отсев сегечЮаесуспендируют в 5 мл дистиллированной воды перемешивают с 8 г смеси ионобменных смол в соотношении 1;1 и помещают в переменное электрическоеполе промышленной частоты (50 Гц) напряженностью 25. В/см, Электроды отделены от реакционной смеси тждпвоводящими пластинами, Через бмин Содержание белка в супернатанте,ед. оптической плот- ностиА Я 2 д 8Таблица 3 Содержание белка в супернатанте, ед. оптической плотности рН водногодезингегра та Время обработки, мин 5,8 0,48 0,58 5,7 0,58 10 4,8 15 П р и м е ч а н и е: Е=25 В/см; АВ:КУ=1:1 Составитель В, ЗайцеваРедактор Л, Пчелинская Техред М.Коштура Корректор Л. Иван Заказ 2411/48 Тираж 528 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий1.13035, Москва, Ж, Раушская набд, 4/5 филиал ПП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 Формула изобретения 1, Способ дезинтеграции микроорганизмов, предусматривающий приготовление суспензии микроорганизмов и ее обработку электрическим полем, о г л и ч а ющ и й с я тем, что, с целью упрощения процесса, обработку суспензии микроорганизмов в электрическом поле осуществляют в присутствии анионобменных или катионобменных смол или их смесей,2. Способ по п. 1, о т л и ч а ю - щ и й с я тем; что обработку проводят электрическим полем постоянного или переменного тока напряженностью 10- 75 В/см, предпочтительно 25-30 Б 7 см.3. Способ по пп. 1 и 2, о т л и ч аю щ и й с я тем, что при использовании смеси анионобменных и катинобменныхсмол последние берут в соотношении от4-1 до 1-4.Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1, фихте Б. А., Гуревич Г. А. и Куд 20 рявцев А. А. Дезинтеграция микроорганизмов. "Итоги науки и техники". Сборник.М., ВИНИТИ, Сер, "Микробилдогия, г.81978, с, 7-93,2. Сытник И. А. и Сытник С, И, Влия 25 ние элекгрогидравлического эффекта намикроорганизмы. -Микробиологическийжурнал. 40, % 4, с, 514 522.еФ3. Ситник С, 1 Бактерициднадезинфз.куюча д 1 я електрог 1 дранл 1 чного ефекЗО ту на сгаф 1 лококи фМ 1 кроболог.чнийжурнал", 39,2, с, 180-184,