Способ иммобилизации транскортина

ц 8108 Б ОПИСАНИЕИЗОБРЕТЕНИЯН АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ Союз Советских Социалистических Республик(61) Дополнительное к авт. свпд-ву - (22) Заявлено 26.09.78 (21) 2668123,28-13с присоединением заявки ЪЪ (23) Приоритет -(43) Опубликовано 07,03.81. Бюллетень ЛЪ 9 (45) Дата опубликования описания 07.03.81(51) Ч К. зС 12 М 11/00 Государственный комитет по делам изобретений и открытий(72) Авторы изобретения Институт биоорганической химииССР1Изобретение относится к способам иммобилизации белков, а именно к способу получения стер оидсвязывающего белка транскортина, иммобилизованного на нерастворимой матрице.ЭИммобилизованный транскортин может применяться в клинической практике для целей конкурентного белковосвязывающего анализа стероидных гормонов в физиологичеСких жидкостях, а также в научно исследовательских целях для изучения механизма связывания стероидов специфическим белком.Известен способ иммобилизации транскортина Ц, который заключается в сле дующем. Транскортин, очищенный хроматографией последовательно на ДЕАЕ-цел;полозе и гидроксиапатите, растворяют в бикарбонатном буфере и смешивают с активированной бромцианом агарозой. Полу ченную суспензию перемешивают гри 4 С в течение 24 ч. Нековалентно связанный с агарозой транскортин удаляют путем последовательных промывок транскортин. агарозы 0,5 М бикарбонатным буфером, 25 цитратным буфером рН 1,1, фосфатным буфером рН 6,0.Очистка хроматографией на ДЕАЕ-целлюлозе и гидроксиапатите не позволяет получить гомогенный транскортин, Приме- зо 2си других белков, иммобилизованных вместе с транскортином, снижают удельную стероидсвязывающую активность транскортина и обуславливают высокий уровень не- специфического связывания стероидов. Последнее исключает применение иммобилизованного по известному способу транс. кортина для анализа некоторых стероидных гормонов, например, прогестерона и 17-окси-прогестерона. Кроме того, условия иммобилизации - применение буфера с рН 1,1 приводят к существенной инактпвации белка. В известном способе нс предусмотрены операции по стабилизации этого лабильного белка, а использован общепринятый унифицированный метод иммобилизации белков.Цель изобретения - получение стаоильного гомогенного препарата и повышение его связующей емкости,Для достижения этой цели согласно предлагаемому способу, включающему растворение транскортина, добавление в раствор активированной нерастворимой агарозы. инкубацию полученной смеси и промь 1 вку образовавшегося иммобилизиро. ванного транскортина, в раствор транскортина перед добавлением агарозы вводят3стероид, агарозу и транскортин берут в соотношении 1:0,002 - 1;0,03, инкубируюч смесь в течение 3 - 24 ч при 4 - 23 С, а иммобилизированный транскортин промывают фосфатным буфером при рН 6 - 8, содержащим стероид в концентрации, равной сго содержанию при иммобилизации транскортина.В качестве стероида используют кортизол в мольном соотношении с транскортином 1:0,5 в -1:3 или кортиокостерон в мольном соотношении с транскортином 1:0,5 - 1:2, или прогестерон в мольном соотношении с транскортином 1:0,5 - 1:1.Способ заключается в следующем.Гомогенный транскортин, выделенный из плазмы ретроплацентарной крови человека аффинной ромотографией, растворяют в фосфатном буфере рН 8,0. Для пре. дотвращения инактивации транскортпна в процессе иммобилизации его связывают со стероидом, имеющим высокое сродство к этому белку. Полученный комплекс сме. шивают с активированной бромциаом агарозой. Процесс иммобилизации проводят при непрерывном перемешивании ь течение 3 - 24 ч при 4- - 23 С. Нековалентно связанный с агарозой траскортин удаляют путем последовательных промывок транскортин-агарозы фосфатным буфером, содержащим 0,5 М 1 аС 1, трис-НС 1 буферомм рН 8,0 (для блокирования остаточны: активных групп агарозы) и фосфатным буфером рН 8,0. Все промывающие буе ры содержат растворенный стероид для предотвращения диссоциации обратимого комплекса транскортин - стероид, иммобилизованного на агарозе. В результате получают стабильную тоехкомпонентную систему агароза-транскортин-стероид. Ковалентная связь между первыми двумя компонентами устойчива к физическим воз действиям, а стероид легко переходит в раствор при повышении температуры до 35 - 40 С. Г 1 ри необходимости удаляют оп. ределенну 1 о часть стероида, варьируя тем самым в широких пределах (от 10 до 90/о) стерондосвязывающую емкость пммобилизованного транскортина.Пример 1, Иммобилизация транскорти. на при охлаждении.10 мг (2,10- моль) транскортина раст. воряют в 5 мл 0,1 М натрийфосфатного буфера рН 8,0, содержащего 0,5 М 1 аС 1 и охлажденного до 4 - 6 С. В полученный раствор добавляют 144 мкг (4 10-: моль) кортизола в 0,2 мл абсолютного этанола.1 г агарозы, активированной бромцианом, промывают на пористом стеклянном фильт ре последовательно 200 мл 0,001 М НС 1.50 мл воды, 10 мл 0,1 М натрийфосфатного буфера рН 8,0, содержащего 0,5 М 11 аС 1. Все растворы имеют температуру 4 - 6 С. К гелю промытой активированной агарозы приливают полученный, как опи 5 10 15 20 с 30 35 40 45 50 55 60 65 4сано выше, раствор комплекса транскор. тин-стероид. Суспензию перемешивают на магнитной мешалке при 4 - 6 С в течение 24 ч, Гель переносят в стеклянную колонку, снабженную пористым стеклянным фильтром, и промывают последовательно 40 мл 0,1 М натрийфосфатного буфера, содержащего 0,5 М ХаС 1, 40 мл 0,01 М трисНС 1 буфера рН 8,0 и 20 мл 0,1 М натрийфосфатного буфера р 1-1 8,0, Все промывающие буферы имеют температуру 4 - 6 С содержат кортизол в концентрации 29 мкг/мл. Химический анализ и определе нис стероидсвязывающсй способности (см. пример 6) показывают, что в препарате иммобилизованного транскортина 1 г ага. розы ковалентно связан с 9,2 мг белка и стероидсвязывающая способность составляет 85% от стероидсвязывающсй способности того же колнчсства пативного (неиммобилизованного) транскортина.Пример 2. Иммобилизация транскортина при комнатной температуре.Используют всс тс реагенты и реактивы, что и в примере 1, в тех же количествах. Проделывают все те операции, что и в примере 1, в той же последовательности, но при температуре 20 - 23 С. Время персмешивания суспензии 3 ч. Проведенный анализ показывает, что 1 г агарозы ковалентно связан с 9,0 мг транскортина, а стероидсвязывающая способность сохраняется на 81/о.Пример 3. Влияние исходного соотношения транскортина и агарозы на количсство иммобилизованного белка и его стероидсвязывающую способность.В целях подбора оптимального соотношсния количеств белка и активированной агарозы к шести пробам активированной агарозы (по 0,1 г) добавля 1 от различные количества транскортина, растворенного в 0,5 мл 0,1 М натрийфосфатного буфера, содержащего 0,5 М 11 аС 1. Каждая проба раствора транскортина, как и в примере 1, содержит двойное количество кортизола в мольном отношении к количеству белка, Процесс для каждой пробы проводят, как описано в примере 1, но объемы промывающих буферов уменьшают в 10 раз. Результаты анализа полученных препаратов транскортин-ага розы представлены в табл, 1.Как видно из данных табл. 1, наиболее эффективно иммобилизация транскортина проходит при таком соотношении количеств активированной агарозы и белка, когда на 0,1 г матрицы взято 1,0 мг транскортина. При указанном соотношении реагентов сохраняется иммобилизованным транскортином высокая стероидсвязывающая активность.Пример 4. Стабилизирующее влияние различных количеств стероида на активность иммобилизованного транскортина.0; (0)3,6; (1 Ос 7,2; (20 с 14,4; (40) 21,6; (60) 39 66 78 85 85 Стеропдсвязывающая способность иммобилнзованного траискортина приведена в процентах от связываюсцей способности натнвного белка (то кс в соотвстствусощик графах табз. 2 и 3). Для подбора оптимального мольного соотподпения транскортина и стабилизиру. ющсго стероида к пяти пробам по 1,0 мг белка, растворенного в 0,5 мл 0,1 М натрийфосфатного буфера рН 8,0 и содержап 1 его 0,5 М )чаС, добавлясот различныс количества стероида, Процесс для каждой пробы проводят. как описано в примере 1, используя 0,1 г активированной агарозы и уменьшая объемы промывающих буферов в 10 раз. Каждьш промывающий буфер содержит стероид в той жс концентрации, какая была создана в данной пробе транс кортина. Результаты анализа полученных препаратов транскортин-агарозы представлены в табл. 2. Из данньсх табл. 2 следует, чго наибольшее стабилизирующее влияние оказывает стероид в мольном отношении к белку) 2:114,4 мкг кортизола на 1,0 мг транскортина). Другие стероидьс, имеющие средство к транскортину одного порядка с кортизолом - кортикостерон и прогестерон - также стабилизируют транскортин в процессе его иммобилизации. Используют мольные соотношения кортикостерон:транскортин 2:1 и прогестерон:транскортин 1:1, Стабилизирующее влияние обоих стероидов равно влиянию эквивалентного количества кортизола.Пример 5. Влияние рН прохсьсвающсго буфера на стероидсвязывающусо способ 35 40 45 50 55 60 65 6ность иммобилизованного транскортина и на количество белка, связанного активированной агарозой.От значения рН промывающсго буфера зависят, во-первых, полное удаление нековалснтно связанного с матрицей транскортина и, во-вторых, сохранение при этом высокой стероидсвязывасосцсй способност белка. С этой целью проводят иммобилизацию пяти проб по 1 мг транскортина на пяти пробах по 0,1 г активированной агарозы в соответствии с примером 1. Г 1 о окончании реакции данную пробу промывают буфером с исследуемым значением рН. Затем промывку ведут, как в примере 1, уменьшая объемы в 10 раз. Результаты анализа полученных препаратов транскортин-агарозы приведены в табл, 3. Из данных табл. 3 видно, что промывка транскортин-агарозы буферами с низким значением рН ( (4,0) существенно инак. тивирует белок. Химический анализ полученных препаратов показывает, что все пробы содержат одинаковое количество белка (в пределах ошибки эксперимента). Следовательно, нст необходимости понижать рН для увеличения десорбпрующеп силы промывающего буфера (как рекомендует унифицированная методика иммобплицацип белков).Пример 6. Химический анализ пммоби лизации белков).Суспензию транскортин-агарозы в воде лиофильно высушивают и определяют сухой вес препарата. Пробу 0,02 г сухого препарата подвергают полному кислотному гидролизу в б н. НС 1 при 110 С в течение 48 ч, В контрольном опыте 0,02 г неактивированной агарозы и известное количество транскортина гидролизуют в идентичных условиях. Состав гидролизата оп. ределяют на аминокислотном анализаторе в стандартных условиях. Количество иммобилизованного транскортина определяют сопоставлением количеств глутаминовой кислоты, аспарагпновой кислоты, глицина и аланина, высвободившихся при гидролизе в опытной и контрольной пробах.Определение стероидсвязывающсй способности иммобилизованного транскортина1 одписное Изд, Ма 234 Тираж 530 ВН 11 ИПИ Государственного комитета СССР но делам изобретений и открьтий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Зак,аз 2146 Загорская типография Упрполпграфпздата Мособлисполкомз 7проводят по предлагаемому способу. Стероидсвязывающую способность нативного транскортина измеряют по общепринятой методике с применением твердофазной адсорбции для разделения свободной и связанной транскортином форм стероида.Предлагаемый способ обеспечивает высокую эффективность (9295 ) иммобилизации транскортина на нерастворимой матрице и позволяет сохранить высокую стероидсвязывающую активность белка (81 - 85 о 4). Такое сочетание названных параметров необычно даже для достаточно стабильных белков.В получаемом по предлагаемому способу препарате иммобилизованного транскор. тина отсутствуют примесные белки, конкурирующие с транскортином за стсроид. Это обусловливает более высокое специфическое сродство транскортина к стерои дам и большую удельную стероидсвязываюшую способность по сравнению с целевым продуктом, полученным по известному способу. Иммоб 1 лизованный гомо енный транскортин мокст храниться при 4 - бС по меньшей мере в течение 8 месяцев без изменения стероидсвязываюшей способности. При получении препарата проводят на всех стадиях процесса иммобилизации операции по стабилизации белка.Применение в прсдлагаемом способе фосфатного буфера с рН б - 8 для растворения гомогенного транскортина, для промывки транскортин-агарозы и для последующего хранения препарата основано, во-первых, на известном факте стабильно. сти гомогенного транскортина в этом буферс и, во-вторых, на том, что этот буфер используют при очистке транскортина до гомогенного состояния, Связывание со стероидом обеспечивает высокую стабильность белка в процессе иммобилизации, а диссоциация лиганда предотвращается введением стеронда в промывающие буферы. 8Использование равных концентраций сте роида в растворе транскортина и промы.вающих буфсрах обеспечивает ту же концентрацию (известную) стероида в полу ченном препарате. Это облегчает количественные расчеты при работе с иммобилизованным гомогенным транскортнном. 1. Способ иммобилизации транскортинапутем его растворения с последующим добавлением в раствор активировашой нерастворимой агарозы, инкубацией получен 15 ной смеси и промывкой образовавшегосяиммобилизованного транскортина, о т л ич а ющи й с я тем, что, с целью получениястабильного гомогенного препарата и повышения его связующей емкости, в раствор20 транскортина перец добавлснисм иарозывводят стероид, агарозу и транскортин берут в соотношении 1;0,002 в :0,03, инкубацию смеси ведут в течение 3 - 24 ч при4 - 23 С, а иммобилизованный транскортин25 промывают фосфатным бус 1 ером при рН6 - 8, содержащим стероид в концентрации,равной его содержанию при иммобилизации транскортина,2. Способ по и. 1, отлнчаО 1 цийсьВ 0 тем, что в качестве стероида используюткортизол в мольном соотношении с транскортином 1:0,5 - 1:3.3. Способ по и. 1, отличаюцийсятем, что в качествс стероида используют35 кортикостерон в мольном соотношении странскортином 1:0,5 - 1:2.4. Способ по п, 1, отличаю щийсятем, что в качестве стероида используют1)огесте 1)он В мо;Ьноа соотно 1 енин с40 транскортином 1:0,5 - 1:1.Источники инфоомации,принятые во внимание при экспертизе1. Заявка Великобритании М 1348935,кл. С 07 С 7/00, 1974.