Способ получения иммобилизованных биокатализаторов

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ Союз Советских Ощиалистичесмих Республик(22) Заявлено 120777 (2 ) 2505482/23-04с присоединением заявки Нов(51)М, Кл,2 С 07 С 7/02// А б 1 К 37/48 Государственный комитет СССР по делам изобретений и открытий(53) УДК 5 7 7. 15,07 (088. 8) Опубликовано 15.11,79, Бюллетень Йо 42 Дата опубликования описания 15,11.79 А.И.Кестнер, М,О,Мандель, И,В,Березин, В,И.Яковлева,Н.Н.Зуева, И.А.Хинт и Л.С,Ванаселья(72) Авторы изобретения Таллинский политехнический институт, Московский орденаЛенина и ордена Трудового Красного Знамени государственныйуниверситет им,М.В.Ломоносова и Специальное конструкторскотехнологическое бюро Деэинтегратор(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ БИОКАТАЛИЗАТОРОВ Изобретение относится к технологическим процессам биохимическогопревращения органических веществ иможет найти применение в микробиологической, химической и медицинскойпромышленности,Известно применение биоорганических катализаторов, в частности иммобилизованных ферментов или ферментных систем, для превращения органических веществ, необходимых для медицинской,химической и пищевой отраслей промышленности.В этих целях нередко используется иммобилизация не только отдельных ферментов,а также целыхинтактных клеток микроорганизмовИммобилизация клеток микроорганизмовдает возможность устранить сложныеРдорогостоящие процессы выделения иочистки исходных ферментов, и проводить сложные ферментативные реакции одностадийным процессом,Чаще всего иммобилизацию клетокосуществляют включением активной 25клеточной культуры в полиакриламидный гель путем совместной полимеризации акрильных мономеров с клеткамимикроорганизмов. Данныи метод широкопримене для иммобилизации клеток микроорганизмов с различной ферментативной активностью. Например, таким способом получены иммобилизированные клетки, обладающие глюкоэооксидазной 1 или аспартаэной активностью 2.ОДнако применение биокаталиэаторов такого типа в технологических установках в непрерывных процессах часто затруднено из-за недостаточных гидродинамических показателей биокатализаторов, полученных путем включения клеток микроорганизмов в мягкие гидрогели, в частности полиакриламидные. Применяемые гели, например полиакриламидный, во время длительной эксплуатации набухают, а под действием гидростатическогЬ давления слой катализатора уплотняется. Эти явл- ния приводят к резкому увеличению гидравлического сопротивления массы катализатора в установке закупорки систем, что затрудняет поддержание требуемого режима в установке.Известен способ получения иммобилиэованных биокатализаторов путем включения биокаталиэатора в армированный неорганическим скелетом гидрогель. Исходными компонентами реак510 15 20 25 ,0 35 40 45 50 5 60 65 ционной смеси являюТся Ферментный белок, 7-12-ный полиакриламидный гель с соотношением акриламида к метиленбисакриламиду 19;1 до 18:2 и инициаторы, например тетраметилэтилендиамин, которыми пропитывают пористый неорганический материал типа силохрома (3) . После осуществления полимеризационного процесса частицы с Ферментативной активностью находят применение в технологических процессах в колонках различного типа. При этом неорганический скелет катализатора обеспечивает необходимую механическую прочность материала и тем самым долговечность применения,Недостатком данного способа является чрезвычайно низкая эффективность процесса иммобилизации ферментативно активных клеток микроорганизмов или их фрагментов. Обычные пористые носители, применяемые для иммобилизации Ферментов и могущие быть неорганической основой для получения армированных катализаторов, обладают мелкими порами, и впитывание микроорганизмов в эти поры невозможно, а увеличение размеров пор приводит к снижению прочности материалов и не позволяет получить армированные катализаторы с необходимыми эксплуатационными свойствами с помощью органических материалов.Целью изобретения является упрощение процесса и улучшение эксплуатационных свойств получаемого биокатализатора.Поставленная цель достигается применением такого носителя, в котором крупные поры сочетаются с достаточной механической прочностью и устойчивостью в водной среде При этом иммобилизованные биокатализаторы получают путем включения клеток Е.со 11 в качестве биокатализатора в армированный неорганическим скелетом, в качестве которого применяют измельченный силикальцит с диаметром частиц 0,1-1,2 мм, обработанный раствором однозамещенного фосфата натрия с последующей термической обработкой при 110-1 ЬО С в течение 1-15 час, 7-12-ный полиакриламидный гель с соотношением акриламида к метиленбисакриламиду19:1 до 18:2.Силикальцит, применяемый в качестве строительных материалов, содержит довольно много свободной извести, которая в водной среде сдвигает рН среды в щелочную сторону и вымывание которой уменьшает прочность материала. При обработке ячеистого силикальцита и подобных материалов растворами фосфорнокислых солей при 110-150 С в течение 1-15 час на внутренней поверхности материала образуется слой Фосфорнокислого кальция. Это снижает вымываемость свободной извести без уменьшения размера пор, но закрепляет структуру исходного материала. Обработанный таким образом силикальцит может долгое время храниться перед применением его для получения биокатализаторов из Ферментативно активных клеток, мономеров и инициаторов полимеризационного процесса.Сравнение работы полученных армированных биокатализаторов с работой колонок с клетками, иммобилизированными в неармированном поли-акриламидном геле, показывает, чтоармированные гели обладают более высокой аспартазной активностью чемсвободные клетки, Кроме того, колонка, заполненная биокаталиэатором,полученным на основе армированногосиликальцитом полиакриламидного геля,работает непрерывно в течение двухнедель без изменения гидродинамических свойств и скорости протеканиясубстрата, а также без сниженияпроизводительности,Получение препаратов с иммобилизованными микробными клетками, обладакщих аспартазной активностью, атакже применение полученных препаратов для превращения Фумарата аммонияв аспаргиновую кислоту поясняетсяследующими примерами,П р и м е р 1, В качестве ферментативно активного материала используют суспензию клеток Е,со 11 с аспартазной активностью, Клетки Е.со 11выделяют из культурной среды ипромывают водой с последующим центри-,Фугированием в течение 10 мин при9000 9. Суспензия клеток микроорганизма содержит 14,9 мг белка в 1 мл,имеет удельную аспартазную активность211 ец, на 1 мг белка за 1 час. Вкачестве носителя используют пеносиликальцит с объемным весом 0,9 т/мудельной поверхностью .140 м /г, удельным объемом пор до 0,27 смэ/г и размером частиц 0,1-1,2 мм, Исходныйматериал обрабатывают 20-ным воднымраствором БаНРО+ в течение 3 час,соблюдая соотйошение 2 мл/г, операцию обработки проводят еще 2 раза,Образуемый осадок фосфатов кальцияотделяют декантированием, а обработанный носитель промывают дистиллированной водой в соотношении 10:1(носитель-вода) и высушивают при110 С в течение 12 час, а затемопрогревают при 150 С в течение 2 час.Реакционную смесь для иммобилизации клеток микроорганизма готовятиз З,б мл описанной суспензии клетокЕ,со 11, 1,0 мл 50-ного растворамономеров (соотношение акриламидак метиленбисакриламиду 19:1), 0,1 мм20-ного раствора надсернокислогоаммония, 0,1 мл 50-ного растворатетраметилэтилендиамина и 300 мгкристаллической калиевой соли аспаргинойой кислоты. При помощи полученной реакционной смеси пропитывают.5,5 г гранул обработанного сухогосиликальцита, Пропитку проводят при8-10 С. После выдержинания в течение 10-15 мин для завершения полимеризационного процесса полученный блок с гранулами силикальцита фрагментируют и промынают 100 мл дистиллированной воды. Готовый сырой катализатор (10 г) н виде армированногополиакриламидного геля с включеннымиклетками микроорганизма обладаетудельной аспартазной активностью15289 ед. на 1 мг белка за 1 час, аобшей - 4400 ед., что составляет 53от исходной общей активности, внесенных при иммобилизации свободныхклеток Е.со 11.П р и м е р 2, Используют суспен Озию клеток и носитель, описанные впримере 1, Для иммобилизации клетокмикроорганизма применяют следующийпорядок операций:60 г силикальцитапропитывают 25 мл суспензии клеток с 25добавкой 3,0 г кристаллической калиевой соли аспаргивной кислоты.Пропитанные суспензией клеток гранулы силикальцита охлаждают до 8-10 С и до"обавляют 22 мл полимеризационной смесиДОполученной смешиванием 10 мл 50-ногораствора мономеров, содержащего акриламид и метиленбисакриламид в соотношении 19:1 соответственно, 9,0 мли 0,1 М фосфатного буфера (рН 8,0) 35и 3,0 мл 10-ного тетраметилэтилендиамина.Последний компонент н качествеинициатора полимеризации (надсернокислый аммоний -3,0 мл 10) добавляют непосредственно перед пропиткойсиликальцита указанной смесью. Пропитанный раствором носитель обрабатынают, как описано в примере 1.Получают 113,8 г катализатора, общая аспартаэная активность которого59,255 ед., что составляет 89 отисходной общей аспартазной активности внесенных свободных клеток. Удельная аспартазная активность иммобилизованных н армированный силикальцитом полиакриламидный гель на 69выше, чем исходных свободных клеток,П р и м е р 3. Биокатализатор,полученный по примеру 2 и имекщийудельную аспартазную активность5555 ед, на 1 мг белка за 1 час сразупосле получения, высушивают при 6 С до воздушно-сухого состояния. Из40 г влажного катализатора получают 27,6 г сухого материала, его 60хранят н сухом виде в закрытых скляноках в холодильнике при 6 С в течение60 дней, После выдерживания к 6,9 г материала добавляют 0,1 М фосфатный буфер до общего объема 15 мл и после 65 набухания гранул носителя в течение20 мин определяют аспартазную активность. Удельная аспартазная активностьпрепарата 54 ед/мг белка, что составляет 98 от активности перед высушиванием,П. р и м е р 4. 70 г катализатора, полученного по примеру 2, помещают в стеклянную колонку размерамиЗх 10,5 см, снабженную водянойрубашкой, Колонку термостатируютпри 37 С и пропускают через нее 1 Мраствор фумарата аммония (рН 8,5)со скоростью 30 мл/час, Элюат, вытекающий из колонки, по данным анализа содержит 90 мг/мл аспаргивнойкислоты и 7,4 мг/мл фумаровой кислоты,что соответствует степени конверсии82. К 1 л элюата добавляют 140 млконцентрированной серной кислоты.Выделяющиеся кристаллы аспаргиннойкислоты отделяют фильтрованием, промывают холодной дистиллированной водой и этиловым спиртом, а затем высушивают на воздухе, Получают 85 гаспаргивной кислоты, которая по полярографическому анализу имеет О)СС21,4 , что соответствует 87содержанию аспаргивной кислоты нс(,-форме. т.пл, 270 С и элементарныйсостав,: С 36,41, Н 5,28 и И 9,43,что близко к теоретическим значениям.Колонку с гранулами биокатализатора используют для непрерывного протока 1 М фумарата аммония в течение15 суток. При этом скороать протекания реакционной смеси через колонкууменьшается лишь на 10, а работоспособность колонки, определяемаяпо синтезу целевого продукта с.-аспаргиноной кислоты, не меняется.Данный способ позволяет получитьбиокатализаторы более эффективнымметодом для осуществления процессовпревращения химических веществ непрерывными методами, Включение клетокмикроорганизмов при полимериэацииакриламидного геля н порах макропористого неорганического носителяпозволяет получать дешевый и технологически удобный биокатализатор.Армированные неорганическими носителями гидрогели с иммобилиэованнымиклетками микроорганизмов могут бытьдлительно использованы без ухудшения гидродинамических показателей внепрерывных процессах получения различных природных соединений. Крометого, полученный катализатор можновысушить и хранить в сухом виде длительное время, он обладает высокойгидродинамической и энзиматическойстойкостью,Формула изобретенияСпособ получения иммобилизованных биокатализаторон путем включения697521 Составитель Г.КонноваРедактор О,Колесникова Техред М.Келемеш КорректорЮ,Макареяк Заказ б 549/10 Тираж 513 Подписное ЦНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб.,д.4/5Филиал ППП Патент, г.ужгород, ул.Проектная,4 биокаталиэатора в армированнЫй неорганическим скелетом 7-12%-ный полиакриламидный гель с соотношениемакриламида к метиленбисакриламиду19;1 до 18:2, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью упрощенияпроцесса и улучшения эксплуатационныхсвойств целевого продукта, в качестве биокаталиэатора используютклетки Е.со 11, а в качестве неорганического скелета - измельченныйсиликальцит с диаметром частиц 0,1-1,Л мм, обработанный раствором однозамещенного фосфата натрия с последующей термической обработкой При 110-150 С в течение 1-18 час,Источники информации,принятые во в нима ние при эксперт и зе1. Патент ФРГ Р 2317 б 80,кл. С А 22/04, опублик. 1973,2. Патент ФРГ Р 2252815,кл. С 07 С 101/22, опублик, 1972,3. Авторское свидетельство СССРР 530885, кл. С 07 6 7/02, 19741 прототип).