Способ выделения l-аспарагиназы

.гс 1б,;,Э" ьуОП И ИЕИЗОБРЕТЕН ИЯ Союз Советских Социалистических Республик404277 К ПАоЕНТУ симыи от ент-М, Кл, С 120 13/1 С 07 д 7/021323069/28-13)Р 1767390.4, ФРГ Бюллетень43 96 явлено осударственный комитетСовета Министров СССРпо делам изобретенийи открытий риоритет 06 Х.1968,публиковано 26.Х.19 К 577.15,07(088.8) ания описания 5.17,197 опубли Авторыизобретени Иностранцы, Вильфрид КауфмАренс и Эккарт Иая Республика Ге ауэнбуш,нн, Э Отто Вагне Клаус Бауер Альфред (Федеративн он анин)Заявитель н страничная фирмаБайер АГя Республика Германн(Федеративн ОСОБ В ЕНИЯ ,-АСПАРАГИНАЗ амина-а-пропил) -метилцианатом; протамин;ный крахмал, полученразложения крахмалаалкиламиноэтилхлоридСущность способа амина с гександиизогистон; катионоактивный путем обменного с гидрохлоридом р-дн- а заключается ЕьсЬегкй ащей н нокислоть толизовточника да - соо рганичеи пептни протеазо тве вуюЯНСО - КН (СН 2) з --СОН СН,), - )Н) с молекулярным можно получать Изобретение относится к микробиологической промышленности.Известен способ выделения Е-аспарагиназы из культуральной жидкости, полученной при ,культивировании ЕзсЬегкгиа соК .предусматривающий осаждение Е-аспарагиназы органическим растворителем, например ацетоном.Предлагаемый способ позволяет более полно выделить фермент из культуральной ж,ил каст,и.Для этого перед осаждением Е-аспарагиназы органическим, растворителем, производят осаждение клеток ЕзсЬепсИа сой в виде хлопьев из культуральной жидкости добавлением в нее органического основания с молекулярным весам более 1000 или его соли с последующим отделением, клеток, например, центровфугированием и экстратированием водой, а добавление органичеокого,растворителя осуществляют в полученный экстракт, 20В качестве основания можно применять акрамин,общей формулы сом выше 1000, который м реакции обмена ди-(3 3 дующем,Выращивают клетки питательной среде, содерж ские ионы и смесь,из ами да в форме клеточных ав :ингидролизов в качестве,и качестве источника углеро щие органические кислоты.,В качестве питательной среды можно использовать замочную кукурузную воду. Хорошие результаты получают, если концентрацию молочной кислоты, содержащейся в замочной кукурузной воде, повышают и добавочно прибавляют ХН ; -ионы, Вместо молочной кисло. ты могут быть также применены янтарная кислота, фумаровая кислота или Е-яблочная кислота, Добавление способных под,действием ЕзсйепсМа соБ к сбраживанию углеводов, например глюкозы, фрчктозы, маннозы, мальтозы, галактозы или аминокислот РЕ-валин, ПУ.-серии, Е-цистеин, Е-триптофан и Р 1- норвалин подавляет синтез, а добавление Е- глютаминовой кислоты, Е-аопарагиновой кис3,06,0(рН 7,0)0,20 Э,ОО 0,30 0,15(рН 7,0) 0,150,202,001,000,20 лоты, О,-аланина и гликоколла способствует синтезу Е-аспарагиназы.Как основа для питательных растворов может быть использован дрожжевой экстракт.Хорошие результаты показали следующие питательные растворы, содержащие, % 1. Воду от замочнойкукурузы (в отношениик сухой субстанции)Мо,почнокислый натрий(ЫН 4) ЯО 4111. Дрожжевой экстрактМолочнокислый натрий(КН 4) БО 4 Эти питательные растворы засевают куль. турой с косого агара ЕясйепсЫа сой АТСС 9637,и культивируют на вибрационной машине около 20 час при 30 С. Значение рН возрастает за это,время до 8,5 8,9.После окончания выращивания в питательный бульон, добавляют органическое основание с молекулярным весом свыше 1000 или его соль.,В результате клетки осаждаются хлопьями н могут быть легче центрифугированы. После двойного суспендирования клеток в воде,их осаждают снова, добавляя ацетон. При этом клетки переводятся в удобную для,переработки форму,и так,изменяются, что образовавшаяся Е-аспарагиназа может быть выделена с водой из раствора в следующей студени. Эта ступень состоит из ,повторного отделения центрифугированием, еще одного двойного суопендирования ,и экстрации водой.Из этой суспензии добавлением одной .из названных органических основ осаждают экстрагированные клетки, нуклеиновые кислоты и балластные протеины и удаляют центрифугированием. Из отстоявшегося водного ,раствора Е-аспарагиназа может быть осаждена при добавлении большого количества ацетона.Вместо ацетона для переведения клеток в другую форму и для осаждения Е;аспарагиназы могут быть применены также другие смешиваемые или только ограничено смешиваемые с водой органические,растворителн (метанол, этанол, изопропанол, метилэтилкетон и диметилсульфокснд),Относительную активность Е-аспарагиназы определяют следующим образом.15,0 см питательногораствора центрифугируют, отстоявшийся раствор удаляют. Клетки бактерий повторно суспендируют в дважды дистиллированной воде до объема 15,0 смз. 5 10 15 20 25 Зо 35 40 45 50 55 50 55 3,0 см этой суспензии клеток разбавляют 12,0 см дважды дистиллированной воды и добавляют 15,0 см 2-ного раствора Е-аспарагина в 1/10 солярнам буферном растворе фоофата со значением рН 7.Затем добавляют 0,2 см толуола.Изготовленную таким образом реакционную смесь, которая содержит 1,0% аспарагина и 1/10 и 1/б первоначально находившегося в питательном растворе концентрата клеток бактерий (1/10 ч или 1/ба), закрыв, резиновой пробкой, встряхивают в течение 3 час при 30 С. По истечении этого времени смесь в течение 5 мин нагревают до 100 С, снова охлаждают и центрифугируют, Отстоявшийся раствор арименяют для калориметрического определения МН,-азота с,реактивом Неслера в отношении стандартного раставора а,ммонийсульфата, При этих условиях опыта от выросших в питательном растворе двух клеток 0,035 до 0,065 Х; от выросших в питательном,растворе трех клеток - 0,04%:1 ч (максимально отщепляемый 1 ч при содержании 1,0% 1.-аспарагина в,реакционной смеси равен001 О 6% Д 1)Чтобы получить значение относительной активности 1-аспарагиназы ЕзсйетгсЬьа соБ умножают калориметрически определенную 1 ч-концентрацию на фактор, разбавления .концентрации находящихся с опытной реакционной смеси клеток бактерий. Относительная активность Е-аспарагиназы выращенных клеток в,питательном растворе 1 смтавляет 0,025 (0,04) Х 10 = 0,25 (0,4); клеток, выращенных в,питательном р астворе 11 - 0,035 (0,065) Х 1 О = 0,35 (0,65); клеток, вы,ращенных в растворе 111 - 0,04 Х 6 = 0,24.П р и м е р 1. 10/0-ный раствор замочной кукурузной водь 1 из,расчета на сухое,вещество посредствам 21 ч раствора КОН устанавливают на значение рН 7, нагревают в течение 20 мин до 120 С и после охлаждения освепляют в центрифуге с верхним отводом жидкости или фильтроваянем методом Зейтца.30 л этого прозрачного раствора заимочной кукурузной воды, разбавляют водопроводной водой,в,количестве 170 л.Для изготовления питательного раствора 1 добавляют 1,2 кг лактата натрия и 0,4 кг сульфата аммония, для изготовления питательного раствора 11 добавляют 0,6 кг лактата натрия, 0,3 кг Е-глютаминовой кислоты-Ха, 0,3 кг гликоколла и 0,4 кг сульфата аммония.Полученный питательный раствор стерилизуют в ферментаторе 40 мин при 110 С, затем охлаждают и инокулируют 500 см выросшей в течение 18 час при 30 С, и встря. хивании:культуры ЕзсЬепсИа сой АТСС 9637 в питательном растворе с рН 7,0, состоящем ,из 1,50 экстракта дрожжей,и 0,50 лактата натрия. Ферментационный затор при 30 С аэрируют воздухом со скоростью 80 л/мин ,при 150 об/мин мешалки.По истечении времени роста от 16 до 18 час, когда рН,культуры повысился нрибли 404277вительно до 8,8, культуральный бульон охлаждают примерно до 20 С. Бактерии, которые содержат Е-аспарагиназу, коагулируют, добавляя 4 л 2,570-ного раствора акримина Л, имеющего формулуСОЫН(СН 2) 6 МНСО 1 х 1 Н (СН 2) 3 Х- (СН 2) 6 - 1 х 1 Нпс молекулярным весом выше 1000, который образуется,при,реакции обменного разложе,ния ди- (3-амино- и-пропил) -метидамина с гександиизоцианатом; затем отделяют в центрифуге с,верхним отводом жидкостями и повторно суспендируют, добавляя водопроводную воду до общего объема 20 л,В полученную суспензию клеток, размешивая, вливают 80 л ацетона, добавляют 20 слР 2,5%-ного акрамина Р, отделяют выпавшие бактерии в центрифуге с,верхним отводом жидкости,и клеточную массу повторно суспендируют в водопроводной водедобавляя ее до общего объема 20 л.Для экстракции из клеток бактерий Е-аспарагиназы суспензию размешивают в течение 4,5 час при ЭОС. В течение этого времени посредством добавки 1 Х патронного щелока или 10%-ной уксусной кислоты поллерживают рН на значении 7,5 - 7,8, Затем охлаждают до 20 С.,В экстрагированную клеточную суспензию, ,размешивая, вливают 5 л 2,5%-ного акрамина Я,и отделяют в центрифуге с верхним отводом жидкости образовавшийся сильный осадок, состоящий .из экстрагированных бактерий и нерастворимого основания - комплекса нуклеиновой кислоты,и протеина. Осадок выбрасывают. Получают приблизительно 17 л,прозрачного раствора, в котором наряду с другими содержащимися в клетках матери алами находится У.-аспаратиназа,Из полученного раствора, добавляя 68 л ацетона, осаждают сырую Е-аспарагиназу, Образовавшийся осадок изолируют, промывают ацетоном и просушивают в вакууме при 25 - 80 С. Получают приблизительно 100 г сырой Е-аспарагиназы с активностью приблизительно 3,3 (при применении питательного раствора 1) или 4,0 - 5,5,ин. ед. на 1 мг (при применении питательного раствора 11). При применении питательного, раствора 111,сырая У,-аспарагиназа содержит приблизительно 2,5 ин. ед. на 1 мг.П р и м е р 2. Катионоактивный крахмал является высокомолекулярным продуктом с молекулярным весом свыше 1000, который образуется при реакции обменного разложения,крахмала с .гидрохлоридом Р-диалкиламиноэтилхлорида.10%-ной ,раствор замочной кукурузной волы (из расчета на сухое вещество) посредством 2 Ж,раствора едкого калия устанавливают на значение рН 7, нагревают 20 мин до5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 С 60 65 120 С и после охлаждения осветляют в центрифуге с верхним отводом жидкости,или фильтрованием методом Зейтца. 30 л этого прозрачного раствора замочной кукурузной воды разбавляют 170 л водолроводной,воды.Для изготовления питательного раствора 1 лобавляют 1,2 кг лактата натрия и 0,4 кг сульфата аммония, для,изготовления, питательного раствора 11 добавляют О,б кг лактата натрия 0,3 кг ,-глютаминовой кис.тоты;Ха, 0,3 кг гликоколла и 0,4 кг сульфата аммония.Полученный питательный, раствор стерилизуют в ферментаторе 40 мия при 110 С, затем охлаждают,и,инокулируют 500 см выросшей в течение 18 час при 30 С, и встряхиваниями культуры ЕзсЬепсЫа соП АТСС 9637 при значении рН 7,0, состоящем из 1,5% экстракта дрожжей,и 0,5% лактата натрия.ферментационный затор при температуре ЗО С, аэрируют воздухом со скоростью 80 лlмин,при 150 обмин мешалки.По истечениями времени роста от 16 ло 18 час, когда рН культуры повысился приблизительно до 8,8,культуральный бульон,охлаждают примерно до 20 С. Бактерии, которые содержат -аспарагиназу, коагулируют посредством добавками 2 л 2,5%-ного раствора катионоактивного крахмала, отделяют в центрн,фуге с верхним отводом жидкости и повторно суслендируют, добавляя водопроводную волу до общего объема 20 л.В подученную суспензию,клетокразмешивая, вливают 80 л ацетона, добавляют 20 смз 2,5%-ного раствора катионоактивного крахмала, отделяют выпавшие бактерии в центрифуге с верхним отводом жилкости,и клеточную массу повторно суспендируют в водопроводной, воде, добавляя ее до общего объема 20 л.Для экстракции из клеток бактерий Е-аспарагиназы полученную суспензию размешивают в течение 4,5 час при 30 С. В течение этого времени посредством, добавки 1 Х натронного щелока,или 10%-ной уксусной кислоты поддерживают рН 7,5 - 7,8. Затем охлаждают до 20 С.,В экстрагированную клеточную суспензию, размешивая, вливают 5 л 2,5%-ного катионоактивного крахмала и отделяют в центрифуге с верхним отводом жидкости образовавшийся сильный осадок, состоящий из экстрагированных бактерий и нерастворимого основания - комплекса нукдеиновой кислоты и протеина. Осадок выбрасывают. Получают,приблизительно 17 г прозрачного раствора, в котором наряду с другими содержащимися в клетках материалами находится Е-аспарагиназа.Из полученного раствора, добавляя 68 .г ацетона, осаждают, сырую Е-аспарагиназу. Образовавшийся осадок изолируют, промывают ацетоном и просушивают в вакууме при 25 до 30 С.,Получают приблизительно 10 О г сырой Е-аспарагиназы с активностью приблизительно 3,0 (при применении питательного раствора 1) или 4,0 - 4,5 ин. ед, на 1 мг (при404277 П р е д м е т и 3 о б р е т е,н и я 35 40 45 50 Составитель В. ДуиьеТехред 3. Таранеико Корректоры В. Брыксинаи В. Жолудева Редактор А. Бер Заказ 214 Изд. Жз 201 Тираж 467 Подписное ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открыз ий Москва, Ж, Раушская наб., д, 4,5Тип. Харьк. фил. пред, Патент применении,питательного раствора 11). При применении,питательного раствора 111 сырая 1.-аспас апиназа содержит приблизительно 2,5,ин. ед. на 1 мг,П р,и м ер 3 10%-ный раствор замочной кукурузной воды (из,расчета на сухое вещество) посредством 21 ч раствора едкого калия устанавливают на значение рН 7, нагревают в течение 2 О мик,до 120 С и после охлаждения осветляют в центрифуге с верхн 1 им отводом жидкости,или фильтрованием,методом Зейтца, 30 л этого:прозрачного раствора заимочной ,кукуруаной воды разбавляют 170 л водопроводной,воды.Для,изготовления питательного раствора 1 добавляют 1,2 кг лактата натрия и 0,4 кг сулцфата аммония.Для изготовления питательного раствора 11 добавляют 0,6 кг лактата натрия, 0,3 кг Е-глюпаминовой кислоты-Ха 0,3 кг гликоколла и 0,4 кг сульфата аммония.Полученный питательный раствор стерилизуют в фер ментаторе 40 мин п ри 110 С, затем охлаждают и инокулируют 500 смз выросшей в течение 18 час при ЗОСи встря. хиваиим культуры ЕзсЛепсИа сой АТСС 9637 при значении рН 7 0, состоящем из 1,5 экстракта дрожжей и 0,5 о/о лактата натрия. Ферментационный затор при 30 С аэрируют воздухом со скоростью 80 л/мин ври скорости вращения мешалки 150 обьиин.По истечении времени роста от 16 до 18 час, когда,рН культуры повысился приблизительно до 8,8 культуральный бульон охлаждают примерно до 20 С. Бактерии, кото,рые содержат 7,-аспарагиназу, хоагулируют посредством добавки 1 л 2,5%-ного раствора основанияс молекулярным весом свьгше 1000, который образуется при,реакции обменното разложения ди-амелина-ц-пропил 1- метиламина с,эпихлоргидрином; отделяют в центрифуге с верхним отводом жидкости, и повторно суспендвруют, добавляя водопроводную воду до общего объема 20 л,5 10 15 20 25 30 Для экстраиции из клеток бактерий 1.-аспарагиназы полученную суспензию размешивают в течение 4,5 час при ЗОС.,В течение этого времени посредством добавин 11 ч натронного щелока или 10%-ной уксусной кислоты поддерживают рН на значении 7,5 - 7,8. Затем охлаждают до 20 С.В экстрагированную клеточную суспензию, размешивая, вливают 2,5 л 2,5%-ного раство,ра основания и отделяют в центрифуге с верхним отводом жидкости образовавшийся сильный осадок, состоящий из экстрапированных бактерий и нерастворимого основания-комплекса нуклеиновой кислоты и,протеина. Осадок выбрасывают. Получают, приблизительно 17 л прозрачного раствора, в котором наряду с другими содержащимися в клетках, материалами находится Е-аспарагиназа.Из полученного, раствора посредством добавки 69 л ацетона, осаждают Е-аспарагиназу, Образовавшийся осадочек изолируют, промывают ацетоном и просушивают в вакууме при 25 - 30 С. Получают цриблизительно 100 г сырой У.-аспарапиназы с активностью приблизительно 3,3 (при применении питательного раствора 1) или 4;0 - 4,5,ин, ед, на 1 мг (при применении питательного раствора 11), При применении питательного раствора 111 сырая 1.-аспарагиназа содержит,приблизительно 2,5 ин. ед. на 1 мг. Способ выделения У.-аспа 1 рагиназы из культуральнойжидкости,полученной при культивировании Езс/тегссЛга сой, предусматривающий осаждение Е-аспарагиназы органическим растворителем, например ацетоном, отличаюи 1 ийся тем, что, с целью более полного выделения фермента, перед осаждением .-аспара пиназы органическим растворителемпроизводят осаждение клеток ЕзсйегссЫа сой в виде хлопьев из культуралыной жидкости добавлением в нее органического основания с молекулярныи весом более 1000 или его соли с последующим отделением клеток, например, центрифугированием,и зкстрагированием водой, а добавление органического растворителя осуществляют в полученный экстракт,