Способ получения щелочной протеазы

0огоз СоветскиСоциалистическиР ЗОБ РЕТ пубп К ПАТ ависим атента 310 Ч.1970 ( 1456462/28-13) л. явлен Приоритет04.И 1.1969 6 а 140990,Государственный квинтеСаввтв Мнннстрав СССРпа девам нзабретеннйн атнрытнй 5,08 (088,8 Опуолико но 22,Ч.1973. Бюллетень3 Дата опубликования описания 29.Х.19 Авторы изобретени(Германская Демократическая Республика) Иностранное предприятие феб Арцнаймиттельверк, ДрезденЗаявитель ОСОБ ПОЛУЧЕН ЛОЧНОЙ ПРОТЕАЗЫ к ферментной прок получению щелочасевают скошент на стерильное для их размноания состоит в ее ни и в течение С, при этом засепитательной среИзобретение относитсямышлепности, в частностиной протеазы.Известен способ получения щелочной протеазы путем выращивания ее продуцентов - плесневых грибов рода Азрегр 11 цз на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли.Предлагаемый способ позволяет получить более активную щелочную протеазу.Согласно изобретению в качестве продуцента протеазы используют штамм Азрегр 11 пз осйгасепз1079.Штамм Азрегр 1 цз осЬгасепз1079 зарегистрирован в институте Микробиологии и экспериментальной терапии в Иене под1 МЕТ РА 126.Способ получения щелочной протеазы заключается в двухстадийном культивировании указанного штамма на питательной среде, содержащей источники углерода - оттек глюкозы и лактозу, источник азота - соевую муку, при температуре 20 - 30 С, преимущественно 25 С, при аэрировании и перемешивании среды.Посевным материалом служат высушенные методом сублимации споры на обезжиренном молоке, хранившиеся при температуре + 4 С. Вначале сухими спорами ный агар, а затем пересеваю просо при температуре 25 С жения и обогащения.Первая стадия культивиров предварительном выращива 48 час при температуре 25 вают 10 - 10 спор на 1 мл ды.0 Затем 10 а предварительно выращеннойкультуры переводят на вторую стадию культивирования н вновь выращивают при температуре 25 С, Питательная среда как на второй, так и на первой стадиях культивирования, 5 может содержать в изменяющихся количествах картофельный крахмал, сухую крахмальную патоку, набухшую целлюлозу, оттек глюкозы, техническую лактозу, соевую муку, жидкий кукурузный экстракт, дрожжевой автоли зат, мяснои отвар, пептон.При культивировании осуществляют контроль значения рН среды, восстанавливающих веществ, активности синтезируемой протеазы.Активность протеазы определяют по моди фицированному методу Кунитца. В качествесубстрата используют казеин.2,9 мл буферного раствора Бриттона - Робинзона с рН 6,0 .и 0,1 мл культурального фильтрата выдерживают в термостате с 3,0 мл5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 3% -ного раствора казенна при 37 С в течение 30 лгин,Затем нерасщенленный казеин осаждают добавлением 3,0 мл 10% -ной трихлоруксусной кислоты и отделяют центрифугированием.Экстинциго не растворимых в трихлор)ксусной кислоте продуктов расщепления измеряют при 280 нлг на спектрофотометрс Спектром он.Таким же образом готовят слепую пробу (без инкубационного периода), а затем производят расчет.Данные о рН-активности протеазы и ее стабильности (через 3 час) приведены на фиг. 1 и 2.П р и и е р 1. Первая стадия - предварительное культивирование, В широкогорлую колбу Эрленмейера объемом 500 лгг наливают 100 лгл питательной среды, содержащей 5% декстрозы из оттека глюкозы, 3% жидкого кукурузного экстракта, 0,5% СаСОз, 0,3% (М 114) БО.ь и водопроводную воду - до 100 мл,Среду стерилизуют, засевают спорами штамма Азрегр 11 цз ос 1 ггасецз1079/1 МЕТ РА 126 в количестве 10 на 1 мл и культивируют при 25 С в течение 48 час при взбалтывании на ротационной вибрационной машине.На второй стадии культивирования в качалочныс колбы,наливают по 100 м,г,питательной среды, содержащей 1% технической лактозы, 4% декстрозы из оттека глюкозы, 1,5% соевой муки, 0,05% КС 1, 0,05% Мд 804 7 НгО, 0,1% КНгРО, 0,001% ЕеЮ 4 7 НгО, и водопроводную воду - до 100 мл, и стерилизуют. Затем эту среду засевают 10% культуры, полученной на первой стадиии культивируют при 25 С,Величина рН среды при этом повышается с 4,7 до 6,6.На седьмые сутки культивирования активность протеазы в культуральном фильтрате равна 7 СЕ на 1 лгл.П р и м е р 2. Первую стадию - предварительное культивирование осуществляют на питательной среде, содержащей 5% декстрозы из оттека глюкозы, 3% жидкого кукурузного экстракта, 0,5% СаСОз, 0,3 (ХН 4)50, 0,1% пепогаоителя, и водопроводную воду - до 40 л.Стерильную среду (стерилизация при 120 С в течение 60 лгик) засевают спорами штамма Азрегр 11 цз осЬгасецз1079/1 МЕТ РА 126 в количестве 5 10 спор на 1 л питательной среды и культивируют при аэрации воздухом в количестве 0,5 л,ггин на 1 А среды, перемешивая со скоростью 300 об(лгин в течение 48 час при 25 С. При этом величина рН среды повышается с 5,0 до 6,0.Полученную таким образом предварительную культуру пересевают в такую же среду, как описана в примере 1.На четвертые сутки культивирования активность протеазы в культур альном фильтр ате составляет 3,5 СЕ на 1 лгл.П р и м е р 3. Опыт осуществляют так же, как описано в примере 1, но на питательной среде, содержащей 0,1% КНРО, 0,05%КС 1, 0,05% Мд 504 7 НгО, 0,01% Ге 504 7 НгО, 4% сахара-сырца, 1% соевой муки, 0,5% картофельного крахмала, 0,1% пептона.При этом величина рН повышается с 5,0 до 8,0. На седьмой день культивирования в культуральном фильтрате определяется активность протеазы - 4,4 СЕ на 1 мл,Характеристика штаммаШтамм Азрегр 11 цз осйгасецз1079 определен по ТНОМ и Карег-критериям.(1 МЕТ РА) М о р ф о л о г и я. Штамм выращен на агаре по Чапек-Доксу с вариантом по Тому.Инкубационная температура 24 С.Период выращивания 9 дней.Носитель конидий неразделенный,Размер 344,5 - 809,9 К 4,48 - 9,94 мк,Пузыри (вестикула).По большей части круглые, частично эллиптические.Продольная ось 17,92 - 39,68 мк, поперечная12,80 - 32,90 мк.Стер и г м ы. В две серии: первая серияразмером 4,80 - 10,56 Р,0,96 мк; вторая серияразмером 6,08 - 8,37 Х 1,28 лгк.С п о р ы, Чаще круглые, частично овальные,но овальные споры не очень сдвинуты в длину.Круглые споры имеют диаметр 2,40 - 2,90 мк,длина продольной оси овальных спор 1,92 -3,24 лгк.Д е ф и с. Частично септирован, имеютсявключения. Размер отдельных клеток 9,39)(Х 0,35 - 2,0 мк,В таблице приведены результаты испытанийштамма Азрегр 1 цв ос 1 ггасецз1079 по отношению к различным веществам, испытаннымна пористых пластиках, 9-дневная культура,.И-источник форма колонии Агар поКогхиллю Глицерин, сахароза Пептон Очень хорошее, охряногоцвета Светло-красноватая, лилово-коричневая, в центре лилово-пурпурное кольцо, края колоний слоновой кости 55 Пивнойсусло-агар Пивное сусло Мальтоза Очень хорошее, охряного цвета59 Центр желто-зеленый,колония бежев атогоцвета Солодовыйэкстракт Солодовый агар24 Желтая ИН 4 ИОз Сахароза Слабое Цвета слоновой кости, складчатая, вдав- ленная 17 Сахараза Хаг 10,Нет роста 26Сироп сухого крахмала Сахароза Дрожжевой экстракт,пептонСветло-желтая,складчатая Складчатость Мочевина 22 Цвета слоновой кости Кукурузная вода ИаХОз30 Колония складчатая Лактоза Очень хоронее, охряногоцвета 25 Маннит То же Светло-коричневая Средне- и темно-ко- ричневая 20 47 То же Росткисолода,сахароза,глюкоза Незначительное светло-охряного цвета Сахароза 54 Нет Нежно-желтая Агар по ЗоппуКукурузного цвета Агар по Раулину Сахароза, винная кислота ИН,ИОР 1 Н,),ЯО,(ХН 4)з НРО 4 17 Цвета слоновой кости, частично вдавлен- ная Поднятая Предмет изобретения среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, от,гичающийся тем, что, с целью получения оолее активной протеазы, в качестве продуцента используют штамм 5 Азрегр 11 цв осйгасецз1079,Способ получения щелочной протеазы путем выращивания ее продуцентов - плесневых грибов рода Азрегр 11 цв на питательной Агар по Чапек-Доксу с вариантом по Тому Агап поЧапек- Доксу Агар по Чапек-Доксу с росткамисолода Аспарагинагар ИаИОз Ростки солода, пентон, ИаИОз Аспарагин Желтоватое оспоренноекольцо Очень слабое, светло-беже- вый Плоская, центр приподнят, белая облачная широкая зернистая зона спорообразования, край широкий, белый, прозрачныйТо же Центр опущен, с утолщением, складчатый, светлый цвет нуги, колония зонирована с различной интенсивностью, радиальная складчатостьЦентр кратерообразный, светло-охряный,слабая складчатость, край широкий, белый, шерстистыйЦентр выпукло-рельефный, складчатый Центр опущен, радиальнаяскладчатость Колония очень плоская,мало воздушного мицелия Центр опущен, колония белая, шерстистая, сильно складчатая Центр кратерообразный, белая, неравномерно складчатая, край волокнистыйЦентр неравномерно утолщенный, бархатистыи, сильно складчатыйоставитель Т. ПолянскаяТехред Л, Богданова торы: Е. Давыдкнн и М. Коробов Белявска едакто Заказ 3021/15 Изд.1927 Тираж 467 ПодписноеЦНИИПИ Комитета по делам изобретений и открытий при Совете Министров СССРМосква, Ж.35, Раушская набд, 4/5 ипография, пр. Сапунова,