Питательная среда для выделения и отбора бактерий продуцентов протеазы

аств на рнонный, кал хл ное обьедидств и железом содержа В.ЮСтап рибаускенинскене8,0-15,01,5-2,5 икум по микроисследования. 0,6 Магний кислый Железо кислое Агар-аг Вода 0,6 е,005-0,021510-25 э 0стальное ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИИ ВТОРСНОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(54) (57) ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ И,ОТБОРА БАКТЕРИЙ - ПРОДУЦЕНТОВ ПРОТЕАЗЫ, включающая источник казеина, агар-агар и воду, о т л и -ч а ю щ а я с я тем, что, с цельюповышения точности выделения и отбора продуцентов, в качестве источникаказенка она содержит окрашенный казеин ОКА-АС и дополнительно глюкозу,крахмал картофельныйрий азотно-кислый,кислый однозамещетый, магний серно-ксерно-кислое при слнии компонентов,г/дОкрашенныйказеин ОКА-АСГлюкозаКрахмал кар. -тофельный ра воримыйНатрийазотно-кислый Калий фосфор- . но-кислыйоднозамещенный Калий хлористыйсерно 1263711В табл.1 представлены средние количественные данные в пределах и за пределами компонентов предлагаемой питательной среды.Для осуществления изобретения готовят питательные среды следующего3состава, г/дм воды:Среда 1.Агар-агар 15,0ОкрашенныйказеинГлюкозаКрахмал картойельныйрастворимый б,ОНатрий азотнокислый 1,ОКалий фосфорно "кислыйоднозамещенный 0,3 З,О 0,3 Изобретение относится к микробиологии и касается состава питательной среды для выделения, отбора и селекции или индуцированного мутагенеэа микроорганизмов - продуцентов протеаэЦель изобретения - повышение точности выделения и отбора продуцентов протеазы.Изобретение осуществляется следую щим образом.Приготовление питательной среды.20 г порошка сухого питательного агар-агара, выпускаемого Дагестанским научно-исследовательским институтом питательных сред, размешиваютв 300 см воды и кипятят 5 мин признепрерывном перемешивании до полного растворения.4 г сухого окрашенного казеина ОКА-АС растворяют в 100 см дистил 5 лированной воды при непрерывном перемешивании на магнитной мешалке.3 оВ 200 см подогретой до 70 С воды растворяют остальные компоненты питательной среды. После этого все компоненты перемешивают, корегируют рН до б 8, доводят общий объем до 1000 см и автоклавируют при 123 С в течение ЗО мин, Далее среду охлажо э дают до 50 С и разливают по 20 см в стерильные чашки Петри. Для проверки на стерильность чашки со средой ,ставят в термостат при 37 С на 24 ч.За пределами указанных значенийо,компонентов питательная среда не оказывает ожидаемого эффекта.Калий хлористый Магний 0,2 серно кислыи Железо .серно- кислоеСреда 2Агар-агарОкрашенныйкаэеинГлюкозаКрахмалкартофельный растворимый Натрий азотнокислыйКалий фосфорно- кислый однозамещенныйКалий хлористый Магний серно кисльп 1 Железо серно- кислое 0,2 О, 002 25,0 1 О 5,0 2,0 20,0 З,О 20 0,8 0,8 Данные, представленные в табл.1,показывают, что за пределами соотношения компонентов полученные данныеблизки к данным оптимальной среды,поэтому нецелесообразно применениепитательной среды с повьипенной концентрацией компонентов.При применении значений компонентов ниже предлагаемых полученные дан 35ные тоже немного отличаются от предлагаемой среди, однако выявляетсятенденция к уменьшению эоны .гидролиза казеина, что ведет к неточностипри отборе бактерий - продуцентовпротеазы.Установлена прямая зависимостьмежду соотношением величины зоны гид.ролиза казеина и диаметра колонии ипротеолитической активностью, что отсутствует при использовании твердойпитательной среды с неокрашенным казеином.В табл,2 представлены результатывыращивания продуцентов пцотеазына5 Отвердой среде с неокрашенным казенном и на жидкой среде,По-видимому каэеин ОКА-АС необходим для биосинтеза протеазы, так какон стабилизирует рост клетки продуцентов.55П р и м е р, Для осуществления изобретения питательную среду гото 3 вят следующего состава, г/дм воды;15,0 Агар-агарОкрашенныйказеииГлюкозаКрахмалкартофельныйрастворимыйНатрий азотнокислыйКалий фосфорно-кислыйодиозамещенныйКалий хлористыйМагний сернокис;лыйЖелезо сернокислс е 3,5 0,5 8,0 0 0,5 0,3 0,3 0,005 Крахмал картофельный нерастворимый Кукурузный экстракт Пивные дрожжи Аммоний фосфорно-кислый двузамещенный Кальций хлористый Натрий хло- ристый 239,00 11,432,19 50 8,40 0,45 0,29 Выделение и отбор продуцентов протеазы.20Стерильные чашки Петри со средой засевают суспензией вегетативных клеток штамма ВасПоз виЬсх 1 з 65, подвергнутых воздействию нитрозогуанидина, и помещают в термостат при 37 С на 36 ч, Варианты, продуцирующие протеазу, оценивают по величине зои гидролиза казеина вокруг колоний. Зоны гидролиза казеина выражены четко, прозрачны на желтовато-оранжевом фоне.Измеряют диаметры колоний и зон гидролиза казеина и вычисляют их соотношение.Выросшие варианты с различной величиной зон гидролиза казеина стерильно микробиологической петлей переносят в пробирки с ломтиком картофеля, а потом засевают биологические пробирки диаметром 18-20 мм с жидкой питательной средой следующего соста 40 ва, г/дм воды:э Калий сернокислый 2,87Магний сернокислый 0,14Медь сернокислая 0,0036Перед добавлением крахмала картофельного нерастворимого в среду производят его осахаривание239 г крахмала заливают 50" см водопроводнойводы, добавляют 150 мг амилосубтилина, нагревают до 70 С и выдерживаютпри постоянном перемешивании 20 мин.Раствор аммония фосфорно-кислогоостерилизуют отдельно при 120 С в течение 30 мин,В 200 см подогретой до 65 С водыз орастворяют остальные компонентыпитательной среды. После этого всекомпоненты. перемешивают, корегируютрН до 7,0, доводят общий объем до1000 см и автоклавируют при 123 Св течение 30 мин,Выращивание проводят глубиннымспособом на качалке в течение 48 -2 ч при 37 С.Протеолитическую активность вкультуральной жидкости определяют поГОСТУ 20264.2-74,Проверена протеолитическая активность 50 вариантов с различным соотношением реэмеров зоны гидролиза казеина и колонии (табл.З).Установлена прямая зависимостьмежду соотношением размеров зон гидролиэа казеина и колоний и протеолитической активностью.В табл.3 даны результаты выращивания продуцентов протеаэы на твердой и жидкой средах.Полученные данные свидете 1 ьствуют о точности выделения и отбора бактерий - продуцентов протеазы на предлагаемой питательной среде, а также . о наличии прямой зависимости между соотношением величины эоны гидролиза казеина и диаметра колонии и протеолитической активностью.Таким образом, предлагаемая питательная среда по сравнению с известной позволяет осуществить более глубокий гидролиз каэеина, зоны гидролиза выражаются четко и являются стабильными,126371 ЬТаблица 1 Соотношение зоны Вариант среды 4,5 Оптимальныезначения Зь 9 3,0 11,0 Запредельныезначения 4,4 11,4 Таблица 2 ьПротеолитическая активность, ед/см Соотношение Колонии 3 пассаж1пассаж 32 15 5 3,5 17,3 10,3 10,0 10,0 8,2 8,3 2,4 19,3 8,0 8,1 10,0 3,97,10,4 10,3 1,8 11,0 9,4 5 4,2 23,4 9,0 9,0 6,4 6,5 6,0 6,3 10,4 10,0 13,912,9 бвб 27,1 6 4,1 10,7 10,1 7 32 200 8 5,0 14,0 12,3 14,9 15,6 15,0 5 ь 1 Ов 2 3,4 14,2 2 вО 12 вЗ 15,8 16,7 16,0 12,5 12,7 6,2 Размер коло- нифвмм Размерзон гидролизаказеи"на,мм зон Гид ролиза с размером ко"лонийвмм Протеолитнческая.активность,едсм гидролиза с размеромколонии,мм,2 4,8 5,6 2,12,27,4,2,1 9,1 9,2,1 3 11,7 1,3. 10,9 15 ф 2 2,0 2,2 1 0,4 Размерэон гидролизаказеина,мм Соотношениезон гидролизас размером колоний,мм2 3пассак пассам пассаа 9,3 10,2 10,2 10,2 10,1 10,0 0,21,223Ф2,0,0 8,6,5,1 10,О 12 в 3 7,9 и ц оотноение зоидролиз Размерколоний,мм ол н 2 и 1 пасас саж саж азмер оний,12,89 13,20 3,1,94 5,00 14 5,05 15,00 0,40 10,58 6,ч 7 0:" 3,РазмерзЪн гидролизаказенка,ми Размерзон гидролиэаказеинии Соотиовениезон Гидфролизас разиром колоний,Продолжение табл.2 теолитическак актнвностьв ед/см Ь12 1263711 КолоРазмер зон гидролиза казенка,мм Размерколоний,мм Соотношение зонгидролизас размеромколоний,мм нии 4 пас 3 пассаж 2 пас 1 пас 10,35 10,15 10,20 10,05 10,00 10,00 9,64 3,0 10,54 10,00 9,94 2,7 10,34 9,98 3,0 8,46 8,48 8,50 8,30 2,0 9,10 8,54 9,00 8,58 2,0 10,30 9,90 10,00 9,95 3,0 12 8,60 830 8,20 8,75 2,2 1 О 8,10 8,00 8,30 7,05 8,40 2,1 10 1,6 7,05 7,00 7,20 8,00 8,15 8,35 2,0 13 2,0 2,0 8,00 830 8,64 8,44 14 5,0 15 4,0 10 10,20 10,80 14)90 14,10 9)90 10,10 13,97 14,90 10,20 10,21 3,0 12 14,10 14,50 9,60 10,50 5,0 2,9 12,9,4 10,15 10,32 13,54 13,10 10,1011,20 13,00 10,3511,60 0,00 3,0 11,00 3,7 14,90 13,50 13)20 13)60 13,10 14,00 4,8 2,0 7,90 8,00 8,35 8,30 8,40 750 8,00 7,98 13,10 12,15 12,90 12,30 13,50 12,70 13,00 12,00 5,14)Ь . 1250 13,90 12,96 13,30 5,0 14,54 15,70 14,90 15,40 6,0 4 3,0 5 3,0 6 3,0 7 2,0 8 3,0 9 4,0 10 4,5 11 4)8 12 3,2 16 , 2,0 10 17 3,5 9,0 18 2,0 9,0 19 30 .90 20 4,0 15,0 21 20 90 22 2,1 10,6 23 4,2 8,4 24 3,2 6,0 25 2,1 10,2 26 3 2 12 8 27 2,3 11,6 28 2,4 14,4 Продолжение табл.3 з Протеолитическая активность)ед(см