Способ проведения ферментативной реакции

, 544380 Своз Советских Социвлистических респубики) М. Кл 3) Приоритет Государственный комитет Совета Министров СССР ло делам изобретенийн открытий уДК 577,151(088 43) Опубликовано 25,01.77, Бюллетень45) Дата опубликования описания 19,04.78 2) Авторы изобретения Иностранць т Эстер Лонг и иненные Штать Иностранная ф Рейнольдс Тоба иненные Штать ЧарльзАмерикирмако КомпаАмерики Марга(71) Заявитель ПОСОБ ПРОВЕДЕНИЯ фЕРМЕНТАТИВНОИ РЕ убстратаосуществИзобретение относится к ферментации, а точнее к процессам превращения различных субстратов в присутствии энзимосодержащих веществ, предварительно обработанных флоккулирующими агентами.Известен способ проведения ферментативной реакции путем контактирования субстрата с суспензией микробных клеток, обладающей ферментативной активностью.Однако такой способ не обеспечивает возможности многократного использования суспензии микробных клеток.С целью обеспечения возможности многократного использования суспензии микробных клеток по предложенному способу их перед контактированием агрегируют, обрабатывая флоккулирующими агентами - полиэлектролитами.При этом перед агрегацией в суспензию микробных клеток можно вводить дополнительно средство, облегчающее фильтрацию жидкости через слой агрегированных клеток, например целит 545.В качестве флоккулирующих агентов применяют анионные или катионные полиэлектролиты.При использовании в качестве с глюкозы ферментативную реакцию ляют при рН 6 - 10 0 - 90 С.Кроме того, агреп ки высушивают перед конта субстратом.Способ осуществляют следующим образом.Ферментативную реакцию проводят путем контактирования субстратов с суспензией микробных клеток, обладающей ферментативной активностью.В качестве микробны.; клеток используют штаммы Аг 111 гоЬас 1 ег 1 чКК 1. В 3724, ХКК 1. В 3725, 1 чКК 1 ВЗ 726, ККК 1. ВЗ 727 и ХКК 1. ВЗ 728, которые культивируют в стерильной среде, содержащей источники углеводородов и неорганических солей,Микробные клетки перед контактированием агрегируют, обрабатывая их флоккулирующими агентами - полиэлектролитами, при этом применяют анионные илп катионные поли- электролиты, такие как Прнмафлок Си Примафлок А, в виде 2%-ного раствора,Флоккулирующие агенты вводят, обычно в количестве 0,05 - 2,50 вес,%, например 0,25 вес. % от веса всей жидкости при легком перемешивании, при этом агрегация осуществляется в течение 10 - 15 мин.Масса флоккулированных клеток осаждается на дно фермснтационного резервуара, 5443803Клетки отделяются путем декантации большей части прозрачной жидкости с последующей фильтрацией на вакуум-фильтре.Для облегчения фильтрации жидкости через слой агрегированных клеток перед агрегацией в суспензию микробных клеток вводятдополнительное средство, например, целит545 в количестве 0,5% (вес/объем).Полученные агрегированные клетки передконтактированием с субстратом сушат при55 С или замораживают при минус 5 С споследующей выдержкой их в замороженномсостоянии в течение 8 час и оттаиванием.Затем агрегированные клетки взмучиваютв воде и измельчают, например с помощьюсмесителя Уоринга.Затем взвесь заливают в колонку, частичнозаполненную водой, где клетки осаждаются.Через колонку пропускают субстрат, например 50%-ный раствор глюкозы, при этом ферментативную реакцию осуществляют при рН6 - 10 при температуре 50 - 90 С.Скорость вывода раствора регулируют так,чтобы конверсия глюкозы во фруктозу составляла 40 - 50/о.Возможна последовательная установка двухколонок и извлечение насадочного материалаиз колонок для последующего применения визомеризации глюкозы, при этом активностьизомеразы сохраняется,Возможно также использование в качествемикробных клеток вида Ягер 1 огпусез, приэтом наиболее пригодными являются Ягер 1 огпусез а 1 Ьцз, Ягер 1 огпусез есЫпа 1 цг, Ягер 1 отусез асйгогподепез, Ягер 1 огпусез о 1 касецзи другие.Способ апробирован в лабораторных условиях.Пример 1. Микробные клетки АгйгоЬас 1 ег МККХ Ввносят в стерилизованнуюпитательную среду состава, /о. 2 декстрозы;0,3 мясного белка; 0,1 дрожжевого экстракта,0 6 (ХН 4) НР 04, и 0,01 Мф 04 7 НО срН - 6,9.Ферментацию проводят при 28 С в течение60 час, после чего рН среды равно 5,5. Затемдобавляют 2% (вес/объем) раствора Примафлок Сдо получения конечной концентрации 0,25% (вес/объем), Предварительно рНполиэлектролитного раствора устанавливают5,0 и ферментационную жидкость во времяего добавления легко перемешивают. Передвведением полиэлектролитного раствора добавляют 0,5 О/, (вес/объем) целита 545 (фирмы Джекс-Менвил, Балтимор).Перемешивают до образования стойких агрегатов клеток примерно, в течение 10 мин,после чего клеточным агрегатам дают возможность агломерироваться, а затем клеточный материал отделяют от прозрачной жидкости с помощью вакуум-фильтра.Агрегированные клетки перед применениемзамораживают при минус 5 С или сушат при55 С.При испытании отделенной культуральной 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 жидкости обнаруживается полное извлечение изомеразы путем флоккуляции.П р и м е р 2. Проводят непрерывную конверсию глюкозы во фруктозу с применением флоккулированных клеток, полученных по примеру 1 и хранившихся несколько часов при минус 5 С.Замороженные флоккулированные клетки погружают в воду или в глюкозный сироп, дают массе клеток оттаять и измельчают их перемешиваппем или другими механическими средствами до получения частиц одинаковой крупности, Затем эту взвесь вакуумируют 30 мин для удаления газов и вносят в колонку диаметром 23,5 мм, имеющую рубашку, частично наполненную водой или глюкозным сиропом.Колонку нагревают до 60 С и пропускают 2 М раствор глюкозы, содержащий 0,004 моля МдС бНО со скоростью, необходимой для получения заданной степени конверсии глюкозы, например, до 50%.П р и м е р 3. Получают сухие флоккулированные клетки и применяют их в колонке при непрерывном процессе изомеризации глюкозы во фруктозу, используя катионный и аниониый флоккулирующие агенты.Пять частей свежей культуры АгйгоЬас 1 ег при рН 5,6 обрабатывают одной частью 1% -ного (вес/объем) раствора катионного Примафлок С.Ферментационную жидкость, содержащую флоккулянт, медленно перемешивают до образования больших клеточных агрегатов, после чего добавляют одну часть 1% -ного (вес/объем) анионного Примафлок А(фирмы Ром и Хаас) и продолжают перемешивание до раздробления больших агрегатов в тонкие частицы. Затем флоккулированным клеткам дают возможность агломерироваться (см. пример 1), прозрачную жидкость отделяют, а клетки отделяют путем вакуум-фильтрациии.Перед добавлением к ферментационной среде рН флоккулирующих растворов устанавливают едким натром, рН раствора катионного Примафлок Сустанавливают 5,0 и анионного Примафлок А- 7,0, а конечный рН составляет 5,6.Отфильтрованные клетки экструдируются через мундштук перед их сушкой в сушилке с принудительной циркуляцией в течение 24 час при 55 С.Высушенные клетки гранулируют в барабане, просеивают до 20 - 40 мин и гранулят помещают в колонку.Изомеризацию глюкозы проводят по примеру 2,Пример 4. Азрегр 111 цз пфег культивируют в питательной среде, состоящей из глюкозы, фруктозы, Мд 504 7 НО, КНРО 4, КН 4 НРО 4, мочевины и кукурузного настоя,По окончании периода ферментации к среде добавляют 0,3% (вес/объем) полиэлектролита, перемешивают до агрегации клеток,Редактор А. Бер Изд. М 319 Тираж 550 Подписное НПО Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Заказ 908/19 Типография, пр. Сапунова, 2 флоккулированные клетки отделяют и загружают в колонку с рубашкой.Колонку нагревают до 40 С и пропускают 5%-ный раствор инвертного сахара, получая жидкую смесь, содержащую глюконовую кислоту и фруктозу.П р и м е р 5. 51 гер 1 огпусез о 11 часецз штамм Мв ИКК 2 Вкультивируют в питательной среде, содержащей, /,: 0,7 ксилозы, 0,3 декстрозы, 0,5 мясного экстракта, О, 25 дрожжевого экстракта, 1,0 пептона, 0,5 ИаС 1, 0,05 Мд 3047 Н 20 и 0,024 СаС 12 6 Н 20.Ферментацию проводят при 28 С 24 час, К ферментационной жидкости добавляют 2% -ный вес/объем) раствор катионного полиэлектролита в количестве, эквивалентном 0,05/о (вес/объем) сухого флоккулянта, жидкость перемешивают до образования агрегированных клеток, после чего перемешивание прекращают и дают возможность последним осесть.Агрегированные клетки отделяют по примеру 1, после чего их сушат 24 час при 60 С, механически измельчают и загружают в колонку, частично наполненную 1,0 М раствором глюкозы,Колонку нагревают до 70 С и пропускают 1 М раствор глюкозы, содержащий О, 04 М раствор МдС 1, бН.О для конверсии глюкозы во фруктозу.П р и м е р б. БассЬагогпусез сегечЫае культивируют в питательной среде, содержащей мелассу. После ферментации добавляют раствор полиэлектролита при перемешивании, достаточном для образования агрегатов клеток.Флоккулированную клеточную массу отделяют и помещают в колонку, которую поддерживают при 60 С.Через колонку пропускают 0,5 М раствор сахарозы, которая превращается в инвертный сахар. 6Пример 7. Азрегр 11 из огукае культивируют в среде, содержащей пшеничные отруби в смеси с углеводами, минеральными и буферными веществами.Ферментацию проводят 48 час при 30 С изатем добавляют раствор подходящего поли- электролита при перемешивании, достаточном для агрегирования клеток.Флоккулирование клетки загружают в ко лонку, поддерживаемую при 50 С. Через колонку пропускают нейтральный 0,2 М раствор ацетил - ДЛ - метионина, содержащий 5 к, Х 10 - " МСо, получают Л - метионин. 15 Формула изобретения1, Способ проведения ферментативной реакции путем контактирования субстрата ссуспензией микробных клеток, обладающейферментативной активностью, отл и ч а ю 20 щ и й с я тем, что, с целью обеспечения возможности многократного их использования,микробные клетки перед контактированиемагрегируют, обрабатывая флоккулирующимиагентами-полиэлектролитами.25 2. Способ по и. 1, отличающийся тем,что перед агрегацией в суспенцию микробныхклеток вводят дополнительно средство, облегчающее фильтрацию жидкости через слой агрегированных клеток, например целит 545.30 3. Способ по пп. 1 и 2, отл ичающийсятем, что в качестве флоккулирую 1 цих агентовприменяют анионные или катионные полиэлектролиты.4. Способ по пп. 1 - 3, отличающийся35 тем, что при использовании в качестве субстрата глюкозы ферментативную реакцию осуществляют при рН 6 - 10 и температуре 50 -90 С,5. Способ по пп. 1 - 4, отличающийся40 тем, что агрегированные клетки высушиваютперед контактпрованием с субстратом,