Способ определения авермектинов

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 18063 21/78 цз 0 ПАТЕНТНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОВЕДОМСТВО СС(ГОСПАТЕНТ ССС ОБ ПАТЕНТУ яется овь акция акти 5 Св щения льтау, для рмек"ИРАС" пока-, ьная погреш- Стьюдента ) ОПИСАНИЕ И(71) Малое государственное предприятие "Бифидум" Научно-производственного обьединения "Биотехнология"(72) В,А.Мосин, В.А,Дриняев и М,Н.Мирзаев (73) В.А,Мосин, В,А.Дриняев и М.Н.Мирзаев (56) Вцгд ВМ. есс, АУеппесбпз пеа ГавИу оУ ротер а)ййе)в)пс)с адептов, Ргос)цс)пд огдап)за апб Теггпеп 1 а 1 оп, Апт)а)сгоЬ, Адепта СЬеаойег; 1979, 15, р. 361-367.Патент Швейцарии М 639422, кл. С 12 Р 19/62, опублик. 1983; Изобретение относится к биотехнологии и касается контроля за производством и применение авермектинов, которые применяются в животноводстве, растениеводстве и медицине для борьбы с андо- и зкзопаразитами животных, растений и человека.Цель изобретения - ускорение и упрощение определения авермектинов за счет использования колориметрического метода определения.На чертеже представлен калибровочный график для определения концентрации авермектинов, построенный в осях 06 зо- С мкг/мл, где Обзо - оптическая плотность при 630 нм, С - концентрация авермекти нов в растворе, мкг/мл, 1 ивермектин, 2 - авермектин В 1 а,Оптическая плотность для авермектинов в интервале концентраций 2 - 20 мкг/мл подчиняется закону Ламберта-Бера. Определение концентраций стандартных растворов авермектинов В 1 и инвермектина .по(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АВЕРМТИНОВ(57) Сущность изобретения; осуществлс помощью цветной реакции с орцинреактивом . в органической фазе, Ремежду авермектинами и орциновым ревом протекает в н-бутаноле при 75-8течение 10-20 мин. Максимум поглоцветного комплекса 630 - 640 нм. Резуты находят по калибровочному графикпостроения которого используют иветин или авермектин В 1. 1 ил., 1 табл,изобретению в соответствии сзали, что средняя относителность (при и= 5, критерии а = 0,95) составляет 5-8%,П р и м е р 1, Определение содержания, авермектинов и препарате ивермектина ф фирмы "Мерк", Навеску ивермектина в коли- С честве 10 мг взвешивают на торсионных ве ф сах с точностью + 2 мг и растворяют ее в (д 100 мл 96% этанола. К 0,2 + 0,01 мл рас- (Я твора добавляют 2,8 + 0,1 мл н-бутанола. а и 2,0 + 0,1 мл орцинового реактива (90 мл 0,1% раствора гексагидрата хлорного железа в концентрированной соляной кислоте и 10 мл 5% раствора.орцина в этаноле). Пробы тщательно перемешивают и помещают в водяную баню при 80 . 1 С на 15 + 1 мин, охлаждают, после чего колориметрируютпри 630 нм против холостой пробы. Содержание авермектинов находят согласно измеренной оптической плотности по калибровочному графику в мкг/мл. Для построения калибровочного графика исполь- ходная навеска имеет вес 94 мг, по прототизовали ивермектин фирмы "Мерк" или авер- пу содержание ивермектина в исходной намектин В 1 в концентрации 2-20 мкг/мл. веске составляет 96 мг,Содержание авермектинов составляет П р и м е р 6. Определение содержания0,98 мкг/мл, следовательно, исходная наве авермектинов в препаратах ивермектинаскаимеетвес 9,8 мг,Попрототипу исходная фирмы "Мерк". Все процедуры проводятнавеска составляет 9,6 мг. так, как это описано в примере 1, за исклюП р и м е р 2, Определение содержания чением того, что пробы фотоколориметрируавермектинов в препарате ивермектина ют при 640 нм против холостой пробы.фирмы "Мерк". Все процедуры проводят "0 Содержание авермектинов составляет 0,93так, какэто описано в примере 1, за исклю- мкг/мл,.т,е. в исходной навеске содержаниечением того, что пробы помещают в водя- авермектиновсоставляет 9,3 мг,попрототиную баню при 75 + 1 С на 20 ф 1 мин. пу вес исходной навески равен 9,6 мг.Содержание авермектинов составляет 0,94 П р и м е р 7. Определение содержаниямкг/мл. Следовательно, исходная навеска 15 авермектинов в препаратах ивермектинаимеет вес 9,4 мг, а по прототипу 9,6 мг, фирмы "Мерк,". Навеску ивермектина в колиП р и м е р 3. Определение содержания честве 10 мг взвешивают на торсионных веавермектинов в препаратах ивермектина сах с точностью ф 2 мг и растворяют в 100фирмы "Мерк". Все процедуры проводят мл.хлороформа. В дальнейшем поступаюттак, как это описано в примере 1, за исклю так, как зто описано в примере 1. Содержачением того, что пробы помещают в водя- ние авермектинов составляет 0,93 мкг/мл.ную баню при 85,. 1 С на 10 + 1 мин. Следовательно, исходный вес навески соСодержание авермектинов составляет 0,98 ставляет 9,3 мг против 9,6 мг по прототипу,мкг/мл; что соответствует исходной навеске П р и м е р 8. Определение содержанияв 9,8 мг, по прототипу 9,6 мг. 25 авермектина в хроматографически очищен- П р и м е р 4. Определение содержания ном препарате .авермектинов серии В изавермектинов в препаратах ивермектина культуральнойжидкости 3. ачегетйз ВКМфирмы "Мерк", Навеску ивермектина в коли. Навеску маслянистой субстанции в кочестве 10 мг взвешивают с точностьюличестве 100 мг взвешиваютнатОрсионных2 мги растворяют ее в 100 мл метанола. 30 весахсточностью . ч. 20 мг. После количеОстальные операции осуществляюттак, как ственного перенесения навески в.мернуюописано в примере 1, Содержание авермек- . колбу на 100 мл масло растворяют в 98тинов составляет,0,96 мкг/мл. Следователь- этаноле, Далее ход анализа аналогичентоно, исходная навеска имеет вес 9,6 мг. С му, как зто описано в примере 1, Содержа- .помощью известного способа определено 35 ние авермектинов в хроматографически9,6 мг.очищенном препарате авермектинов серииП р и м ер 5. Определение содержания В из культуральной жидкости . ачегабИзавермектинов в препаратах ивермектина ВКМ АС 1301 составляет 0,85 мкг/мл. Слефирмы "Мерк",Навескуивермектинавколи- довательно, в исходной навеске масляничестве 100 мг взвешивают на торсионных 40 стого препарата авермектинов серии. Ввесах с погрешностью + 20 мг и раство- .содержание авермектинов составляет 85 мг,ряют ее в 100 мл ацетона. С помощью буга- по прототипу определяется 80 мг авермектинола 1 мл полученного раствора разводят в нов в препарате авермектинов серии В,10 раз, К 0,2 + 0,01 мл разведенного рас- П р и м е р 9. Определение суммарноготвора добавляют 2,8 + 0,1 мл орцинового 45 содержания авермектинов в культуральнойреактива(90 мл 0,1% растворагексагидрата жидкости Зтгертовусез ачегвсИз ВКМ АСхлорного железа в концентрированной со. Культуральную жидкость Зтгертоаусезляной кислоте и 10 мл 5% раствора, орцина ачегпъЮИз ВКМ АС 1301 в возрасте 168 часовв этаноле). Пробы тщательно перемешива- в количестве 10 мл центрифугируют при 3000ют и помещают в водяную баню при 50 оборотах в минутувтечение 20 мин. Надоса 80 + 1 С на 15 + 1 мин, после чего дочнуюжидкость сливают. Косадкудобавляпробы колориметрируют при 630 нм противют 10 мл дистиллированной воды,холостой пробы. Содержание авермектинов охлажденной до температуры 4 С, Осадокнаходят согласно измеренной оптической суспендируютивыдерживаютпритемпераплотности по калибровочному графику в 55 туре 4 С в течение 5 мин, Суспензию центмкг/мл, который строят с помощью ивер-рифугируют при 3000 об/мин в течение 5мектина фирмы "Мерк" в концентрации 2- мин, Надосадочнуюжидкостьотбрасывают,20 мкг/мл. Содержание авермектинов а к промытому осадку добавляют 10 мл 96%составляет 0,94 мкг/мл. Следовательно, ис- этанола. Осадок суспендируют и выдержи1806351 Формула изобретения Сравнительные данные определения содержания авермектинов в чистых препаратах и в авермектинсодержащих субстанциях.Содержание авермектинов, мг определенное по способИсточник авермек- тинов Пример П ототип П е лагаемый 10,0 + 2,0 Ивермектин фирмы Мерк 9,8 9,6 9,6 9,6 . 9,6 96,0 9,6 9,6 80,0 2 3 .5 6 7 8 и и 9,4 9,8 9,6 94,0 9,3 9,3 85,0 и и и н и иги и и и н н 1000 ч. 20 0 10,02,0н и н Хроматографически очищенный авермектин серии В МицелийВКМ АС 1301 60,0 мкг/мл 68,0 + 8,0 мкг/мли н г вают при комнатной температуре в течение 20 мин при постоянном перемешивании. Пробы центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 мин, К 0,2 .ф. 0,01 мл экстракта . авермектинов добавляют 2,8 ч. 0,1 мл нбутанола и 2,0 й 0,1.мл;орцинового реактива, Далее поступают так, как описано в примере 1. В мицелии З.ачегаЮз ВКМ АС 1301 определено 60 мкг/мл авермектинов, по прототипу продуктивность ВКМ АС 1301 составила 70 мкг/мл.П р и м е р 10. Определение суммарного содержания авермектинов в культуральной жидкости З.ачеггптз ВКМ АС 1301 при первичном скрининге культуры, Культуральную жидкость Я;ачегвЮз ВКМ АС 1301 в возрасте 168 часов в количестве 10 мл от 100 моноизолятов (100 образцов) центрифугируют при 3000 об/мин. Остальные процеду ры выполняют так, как описано в примере 1. Средняя продуктивность по предлагаемому методу составила 68 + 8 мкг/мл про,тив 75 + 5 мкг/мл по прототипу. Следовательно, время анализа 100 образцов по предлагаемому способу занимает 170 мин, в то время как анализ 100 образцов по способу прототипу 3075 мин. Иначе говоря, время анализа сокращается в 30 раз.Было установлено, что проведение цветной реакции при температуре выше 85 + 1 С.атакжеменее 15 иболее 20 мин нецелесообразно, так как это влияет на точность результатов. В первом случае иэ-эа резкого испарения органических растворителей, а во втором - в силу недораэвития 5 окрашивания, если нагревание осуществляется менее 15 мин или в силу того, что интенсивность скрашивания уменьшается после достижения максимума, когда нагревание длится более 20 мин, Использование 10 температуры 75 + 1 С приводит к увеличению времени проведения цветной реакции. Фотоколориметрирование образцов. при длине волны ниже 630 и выше 640 нм также нецелесообразно, так как максимум 15 поглощения света цветным комплексом наступает при указанных длинах волн,20 . Способ определения авермектинов,включающий растворение анализируемой пробы в органическом растворителе и измерение оптической плотности, о т л и ч а ющ и й с я тем,.что, с целью упрощения и 25 ускорения, к раствору пробы в органическом растворителе добавляют раствор орцинового реактива в н-бутаноле, нагревают в течение 15 ч. 5 мин при 80 + 5 С и измеряют оптическую плотность получен ного окрашенного раствора при 630-640 нм,1806351 630 Составитель В.МосиТехред М.Моргента ар ректор А.О акто льский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина,оизводственно-из Заказ 973 . Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5