Способ получения сорбента для выделения фибронектина

(19)(11) 51)5 В 01 1 2 ц/30 К 3/2 Я САН ЕТЕ О СТВУ ищенного фибра СУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ И ГКНТ СССР ВТОРСКОМУ СВИДЕ(71) Научно-производственный центр медицинской биотехнологии и Институт биоорганической химии им. М.М,Шемякина (72) М.А.Грин, А,Е.Иванов, Г.А.Афанасенко, В.П.Зубов, В.В.Жильцов и В.В.Гузеев (56) йедпац 11 Ч., ЙЬат С., Юо 3 а Л. АНпту рцгИсатоп о 1 Ьцвап равва ОЬгопесйп оп ввоЫИес 3 деатп - .).СЬгов, 1988, ч,432, р.93 - 102.(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СОРБЕНТА ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ ФИБРОНЕКТИНА Изобретение относится к медицинской биотехнологии,в частности к усовершенствованному способу получения биоспецифического сорбента для выделения и очистки биологически-активного белка - фибронектина.Фибронектин - высокомолекулярный полифункциональный гликопротеин, который принимает участие в различных функциях клеток, включая адгезию клеток, формирование экстрацеллюлярного матрикса и изменения цитоскелета, клеточную подвижность, фагоцитоз, дифференцировку и онкологическую трансформацию.Известен способ получения сорбента для выделения фибронектина путем иммобилизации желатина на Сефарозе С:4 В, активированной бромцианом. Полученный таким способом сорбент содержит желатина 3-5, мг на 1 мл геля и имеет емкость по фибронектину - 1 мг на 1 мл геля, Элюция буфером, содержащим ЗМ мочевину, приво(57) Сущность изобретения: сорбент получают путем иммобилизации желатина на активированной пористой кремнеземной матрице, причем в качестве матрицы используют пористое стекло, модифицированное сшитой полиакрилатной оболочкой, содержащей активные и-нитрофенилакрилатные группы в количестве 2 - 90 мкмоль/г матрицы, а иммобилизацию желатина проводят путем инкубации матрицы в 1 - 3- ном растворе желатина в растворе бикарбоната натрия с рН 8 - 9. 3 табл. дит к десорбции высокоочнектина с 65 О выходом.Однако недостаточно высокий выход белка, низкие механические и гидродинамические характеристики сорбента не позволяют использовать его в крупномасштабной хроматографии фибронектина,Известен способ получения сорбента для выделения фибронектина, основанный на иммобилизации желатина на карбоксиметилцеллюлозе, активированной тионилхлоридом. Элюция белка с сорбента осуществляется 4 - 4,5 М раствором мочевины при рН 7,4-7,5. Использование данного сорбента позволило повысить выход фибронектина в 1,5 раза по сравнению с желатинСефарозой и достигнуть 90;4 чистоты белка.Однако желатин-КМ целлюлоза, представ. ляющая собой набухающий в воде пористый мягкий органический гель не может быть использована для препаративной наработки фибронектина.производительностью 0,043 - 0,067 мг/млх хмин.Целью изобретения является упрощение способа и повышение производитель ности сорбента в процессе выделения фибронектина,Поставленная. цель достигается описываемым способом получения сорбента для выделения фибронектина, заключающимся 45 в том, что в качестве активированной матрицы для связывания желатина используют пористое стекло, модифицированное сшитой полиэкрилатной оболочкой, содержащей активные и-нитрофенилакрилатные 50 группы в количестве 2-90 мкмоль/г матрицы, Процесс иммобилизации проводят путем инкубации матрицы с 1-3 раствором желатина в растворе бикарбоната натрия при р Н 8-9. 55Способ осуществляют следующим образом.П р и м е р 1, Получение сорбента для выделения фибронектина желатин-МПСПА). Наиболее близким по технической сущности и достигаемым результатам к настоящему изобретению является способ получения сорбента для выделения фибронектина путем иммобилизации желатина на силикагеле, активированном глутаровым диэльдегидом и нитритом натрия. Иммобилизацию желатина проводят одновременно с активацией силикагеля и последующейсшивкой желатина бисакриламидом. Указанный способ позволяет получить сорбент с повышенной емкостью (1,3 - 2,2 мг фибронектина на 1 мл носителя). Полученный сорбент обладает высокой стабильностью и не теряет своих свойств при 50-кратном использовании в течение 3-х месящев работы, Основным недостатком вышеуказанного способа является его двухстадийность и использование целого ряда органических реагентов, в том числе высокотоксичного биса криламида.К недостаткам указанного способа также можно отнести то, что полученный согласно ему сорбент не предназначен для препаративного выделения фибронектина, а служит лишь для аналитического определения фибронектина в плазме крови. Использование сорбента для препаративной очистки фибронектина иэ плазмы ограничено малой производительностью сорбента при хроматографии допустимая скорость потока плазмы через колонку объемом 2,5 мл составляет 0,25 - 0,5 мл/мин). В связи с этим сорбент по способу-прототипу позволяет получить биоспецифически сорбированный фибронектин 101520 25 30 35 В колбу, содержащую 250 мл 20/ раствора желатина в 0,3 М растворе бикарбоната натрия с рН 8,5, вносят 50 г биосорбента МПС-ПА, перемешивают и инкубируют в течение суток при умеренном встряхивании, после чего в реакционную смесь добавляют 5 мл зтаноламина, перемешивают и выдерживают еще сутки, Полученный сорбент промывают физиологическим раствором, 0,05 М трис-НС буфером рН 7,5, содержащим 1 М МаС 1 и 4 М мочевину для удаления несвяэавшегося желатина и уравновешивают в 0,02 М цитратном буфере рН 7,5, содержащем 0,01 М зпсилон-аминокэпроновую кислоту и 1 М йаС и используют для выделения фибронектина из бычьей плазмы. Емкость полученного сорбента составила 2,2 мг фибронектина на 1 мл сорбента,П р и м е р 2. Синтез сорбента проводятаналогично примеру 1, с тем отличием, чтоиспользуют 10 раствор желатина. Получают сорбент, имеющий емкость 2,0 мг фибронектинэ на 1 мл сорбента,П р и м е р 3. Синтез сорбента проводят аналогично примеру 1, с тем отличием, чтоиспользуют 3 раствор желатина. Получают сорбент, имеющий емкость 2,5 мг фибронектина на 1 мл сорбента,Используемый диапазон концентрацийжелатина является оптимальным по параметру числа активированных групп, находящихся на сорбенте.П р и м е р 4, Инкубацию раствора желатина с биосорбентом МПС-ПА проводят при рН 8,0, Полученный сорбент обрабаты" вают по примеру 1. Он имеет емкость 2,0 мг фибронектина на 1 мл сорбента.П р и м е р 5. Инкубацию раствора желатина с биосорбентом МПС-ПА проводят при рН 9,0. Полученный сорбент обрабатывают по примеру 1. Он имеет емкость 2,4 мг фибронектина на 1 мл сорбента,П р и м е р 6. Инкубацию раствора желатина с биосорбентом МПС-ПА проводят при рН 7,5. Полученный сорбент обрабатывают по примеру 1. Он имеет емкость 0,8 мг фибронектина на 1 мл сорбента.П р и м е р 7. Инкубацию раствора же. латина с биосорбентом МПС-ПА проводят при рН 9,5. Полученный сорбент обрабатывэкп по примеру 1. Он имеет емкость 1,0 мг фибронектинэ на 1 мл сорбента.П р и м е р 8. Хроматографическое выделение фибронектина из бычьей плазмы на желатин-МПС-ПА,На колонку размером 1 х 3,2 см (объем 2,5 мл), заполненную сорбентом по примеру 1, наносят со скоростью 5 мл/мин 25 мл бычьей плазмы. Колонку промывают 0,02 М цитратным буфером рН 7,5, содержащим 1М КаС и 0,01 М эпсилон-аминокапроновую кислоту до нулевого значения поглощения при 280 нм, и далее элюируют специфически сорбированнцй фибронектин 0,05 М трис-НС буфером рН 7,5, содержащим 1 М МаС и 4 М мочевину. Собирают фракции объемом 3 мл и измеряют их оптическую плотность при 280 нм, Элюат обессоливают на Сефадексе 0-25, используя 0,02 М цитратнцй буфер рН 7,0, содержащий 0,05 М МаС и 0,05 М трилона Б. Производительность сообента в процессе выделения фибронектина составила 0,44 мг/мл мин.Сравнительные характеристики сорбента, полученного заявленным способом и известным, представлены в табл.1.Емкость и производительность сорбентов, полученных по примерам 1-8, при пропускании 25 мл бычьей плазмы со скоростью 5 мл/мин через колонку с 2,5 мл сорбента, а также выход фибронектина в данных примерах представлены в табл.2.Из данных табл,1 и 2 следует, что при сохранении емкости и увеличении производительности сорбента, полученного по описываемому способу, по сравнению с сорбентом, полученным по способу-прототипу в 10 - 11 раз. выход фибронектина не уменьшается (0,22 мг/мп по описываемому способу против 0,215 мг/мл по способу-прототипу).П р и м е р 9, Препаративное выделение фибронектина из бычьей плазмы в режиме п ЬатсЬ.В 1400 мл бычьей плазмы вносят 400 мл биосорбента желатин-МПС-ПА, полученного по примеру 1. Проводят сорбцию в объеме при перемешивэнии в течение 1 ч. Супернатант удаляют, сорбент промывают .0,02 М цитратным буфером рН 7,5, содержащим 1 М йаС и 0,01 М эпсилон-аминокапроновой кислоты для удалениянеспецифически сорбированных белков до нулевого поглощения при 280 нм. Отмытый сорбент вносят в 400 мл 0,1 М трис-НС буфера рН 7,5, содержащего 8 М мочевины и 2 М йаС. Элюцию проводят в объеме в течение 15 мин. После удаления элюата вторично проводят элюцию и так до полной десорбции фибронектина с сорбента, Затем эпюат обессоливают на Сефэдексе 6-25, используя 0,02 М цитратный буфер рН 7,0, содержащий 0,05 М йаС и 0,05 М трилон Б, 10 15 20 Хмин) 50 25 30 35 40 Таким образом, полученный описываемым способом сорбент может быть использован в крупномасштабном производстве фибронектина,Проведен сравнительный эксперимент по излучению кинетики сорбции фибронектина на известном (Желатин-Силикагель) и полученном (Желатин-МПС-ПА) сорбентах. Сравнение проводили с использованием 100 мл бычьей плазмы и ЗО мп указанных сорбентов, Результаты представлены в табл.З.Как видно из данных табл.З, максимальная емкость известного сорбента достигается за 1 ч, тогда как описываемого сорбента - за 10 мин, Таким образом, и в ЬатсЬ - варианте сорбции сорбент ЖелатинМПС-ПА оказывается в 1 О раэ производительнее, чем Желатин-Силикагель (для Желатин-МПС-ПА производительность равна 2,2/10 = 0,22 мг/мл мин, тогда как для Желатин-Сипикагеля - 1,5/60 = 0,025 мг/млх Препарат фибронектина, полученный с использованием сорбента по описываемому спосабу, характеризуется высокой гомогенностью по данным эпектрофореза в ПААГ. Сорбент выдерживает непрерывную эксплуатацию в течение 4 месяцев без заметных изменений емкости и производительности,Таким образом, описываемый способ позволяет упростить процесс получения сорбента для выделения фибронектина за счет одностэдийности и исключения использования токсичных соединений и повысить производительность сорбента при сохранении его специфической емкости,Формула изобретения Способ получения сорбента для выделения фибронектина путем иммобилизации желатина на активированной пористой кремнеземной матрице, о т л и ч а ющ и й с я тем, что, с целью упрощения способа и повышения производительности сорбента в процессе выделения фибронектина, в качестве матрицы используют пористое стекло, модифицированное сшитой полиакрипатной оболочкой, содержащей активные и-нитрофенилакрилэтн ые группы, в количестве 2 - 90 мкмоль/г матрицы, а иммобилизацию желатина проводят путем инкубации матрицы, в 1 - 3 -ном растворе желатина в растворе бикарбоната натрия с рН 8-9,1777951 Таблица 1 Параметры хроматографической очистки фибронектина на сорбенте по предлагаемому способу и по способу-прототипуТаблица 2 Таблица Составитель Л, Платоновадактор С. Кулакова Техред М.Моргентал Корректор И. Муска Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина, 101 каз 415 ВНИИ Тираж Подписноесударственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СС 113035, Москва, Ж, Раушская наб 4/5