Средство для реконструкции мембран in viтrо

(5)5 А 61 К 5, 37 АНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ д я к биохимиитва для реконст С 4 ГОСУДАРСТ 8 ЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТ(71) Научно-исследовательский институт идиатрии Республиканского научного центохраны здоровья матери и ребенка(56) Авторское свидетельство СССРМ 1673969, 1987,Изобретение относитс и касается реактива - средсрукции мембран и УТго.Цель изобретения - повышение специфической активности,П р и м е р 1, В круглодонную колбу объемом 500 мл помещают 2 г фосфатидилхолина хлопчатника, добавляют 20 мл диэтилового эфира. закрывают колбу пробкой и перемешивают содержимое до полного растворения фосфадилхолина (ФХхл), Диэтиловый эфир упаривают досуха на роторном испарителе при Т=40 С, приливают к содержащемуся на станках колбы ФХхл 100 мл 0,20-ного раствора тринатриевую соль глицирризиновой кислоты (йазГК) в 130 мм трио-буфера (рН,4), содержащего 200 мг йазГК, Интенсивно перемешивают содержимое до полного отделения ФХхл от стенок колбы и его солюбилизации. Образовавшуюся мутную жидкость переносят порциями по 4,0 мл в стеклянные стаканы, помещают их в емкость со льдом и воздействуют ультразвуком с частотой 44(54) СРЕДСТВО ДЛЯ РЕКОНСТРУКЦИИ МЕМБРАН й ЧТЙО(57) Изобретение относится к биохимии и касается средств для реконструкции мембран и чтго, Цель изобретения - повышение специфической активности. Предлагаемое средство состоит из фосфатидилхолина хлопчатника и тринатриевой соли глицирризиновой кислоты при соотношении 1,0:0,1 - 0,2. Полученное средство применяется как реактив для реконструкции мембран при биохимических исследованиях. 4 табл. кГц на ультразвуковом дезинтеграторе до получения прозрачной опалесцирующей жидкости, Общее время воздействия ульт- Я развука составляет 15 мин, Голученную жидкость центрифугируют при ЗО 000 об/мин в течении 15 мин, Центрифугат использовали для репарации поврежденных мембран клеток печени. Получившая сус пензия содержит 20 мг ФХхл и 2 мг йазГК в 1 мл, рН суспензии 7,4; размер частиц 36 - 40 нм, осмолярность 210 мосмоль, оптическая плотность при Ь 660 нм составила 0,057. адсорбции суспензии при Х =660 нм - 91;, прозрачность максимальная,П р и м е р 2. По примеру 1 в круглодонную колбу вносят 2 гр, ФХхл и растворяют его в 20 мл органического растворителя. После полного растворения ФХхл диэтиловый эфир упаривают на роторном испарителе при Т=40 С. Затем к ФХхл, выкристаллизовавшемуся на стенках колбы, приливают 100 мл 130 мМ трис-НС буф.раствора, содержащего 300 мг йазГК. Интенсивно перемешивают до его полной солюбилизации,10 15 35 Образовавшуюся мутную жидкость в стаканы для ультразвукового озвучивания и на холоду воздействуют ультразвуком с частотой 44 КГц в течении 15 мин, Полученную прозрачную жидкость центрифугируют при 30 000 об/мин в течение 15 мин, Полученная суспензия содержала 22 кг Фххл и 3 кг мг НазГК в 1 мл и имела следующие физико-химические свойства, рН,38, размер частиц 35-40 нм, осмолярность 210 мосмоль, оптическая плотность при Л -660 нс 0,06; адсорбция суспензии при Л 660 нм составила 89,00, прозрачность максимальная. П р и м е р 3, По примеру 1, 2, 5 г ФХхл растворяли в 20 мл органического растворителя, высушивали его на роторном испарителе и солюбилизировали в 100 мл 130 мм трис-НО буф, раствора, содержащего 400 мг МазГК. При выборе оптимальных концентраций составных частей суспензии испытаны следующие концентрации тринатриевой соли глицирризиновой (йазГК):0,05; 0,1; 0,15; 0,2; 0,25 мас,ч. на 1,0 мас,ч, фосфатидилхолина,Об эффективности действия препарата судили по замедлению инактивации цитохрома Рв поврежденных микросомах после инкубации их с суспензией (повреждение микросом вызывали введением крысам гепатотоксинов СС 4 и гелиотрина). Количественно замедление инактивации цитохрома Ропределяли по времени полуинактивации его т у Результаты исследований представлены в табл, 1.Из таблицы видно, что концентрация КазГК 0,05 мас.ч. недостаточна для максимального проявления репарирующей способности препарата, при концентрации МазГК от 0,1 до 0,2 мас,ч. наблюдали максимальный репарирующий эффект препарата. а при концентрации 0,2 и выше эффективность препарата оставалась без изменений, что явилось обоснованием для выбора концентрации МазГК; 0,1 - 0,2 мас,ч, на 1,0 мас,ч, фосфатидилхолина хлопчатника,Конкретные примеры применения средства.Об эффективности реконструкции мембран микросом печени в экспериментах гп чтго судят по скорости инактивации циотохрома Рскрининг тесту, специфичному для повреждения эндоплазматического ретикулума печени.Острые токсические повреждения печени вызывали введением гепатотропных 20 25 30 40 45 50 55 агентов: четыреххлористый углерод и гелиотрина. Фосфолипидными препаратами взятыми для сравнительного изучения их эффективности явились; 1) фосфотидилхолин хлопчатника с тринатриевой солью глицирризиновой кислоты (по предлагаемой суспензии для реконструкции мембран) ФХхл+КазГК; 2) фосфадилхолин хлопчатника с солодковым пенообразователем ФХхл+ГК; препарат Эссенциале-фирмы Наттерман, ФРГ.С целью репарации мембран микросхем, а также сравнения эффективности фосфолипидных препаратов фракцию мембран микросом выделяли из печени крыс с острым токсическими гепатитами, затем инкубировали их с препаратами фосфолипидов и регистрировали скорость инактивации цитох рома Р.Инактивацию цитохрома Риспользавали как тест для определения состояния мембран. Инактивацию регистрировали в течение 20 мин при 37 С,Из таблицы видно, что время полуинактивации фермента при острых токсических воздействиях на печень резко снижается (5- 8 мин), О хорошем репарирующей действии препаратов ФХхл+МазГК и ФХхл+СП можно судить по возрастанию времени полуактивации цитохрома Р, тогда как препарат эссенциале не оказывал репарирующего действия на поврежденные микросомы печени. Репарация мембран эндоплазматического ретикулума печени крыс, поврежденных фосфолипазой А 2.В опытах и чего использовали фосфолипдзу А 27 А 2) из пчелиного яда (ех Вге чепигп) фирмы "СабосЬепз" (США) удельная активность которой равнялась 1000 ед, в мг, фосфолипаза А 2 - фермент, гидрализующий фосфОЛИПИДЫ (В ОСНОВНОМ фОСфдТИДИЛХО лин в,д -положении), Микросомы в этой серии выделяли из печени здоровых крыс. Микросомы инкубировали с 7 А 2 В табл, 3 определено время полуинактивации (т 1/2 цитохрома Рв микросомах, поврежденных фосфолипазой А 2,Предлагаемое средство позволяет повысить уровень времени полуинактивации цитохрома Р, что свидетельствует о репарационной активности предлагаемого средства,Изучение восстановления функциональной активности поврежденных мембран.1747072 Таблица 1 Время полуинактивации цитохрома Рв поврежденных микросхемах печени крыс и проинкубированных с суспенэифйП р и м е ч а н и е: т 1/2 цитохрома Рв поврежденных микросхемах беэ инкубации с суспенэией при ССИ гепатит 5 мин., при гелиотриновом 8 мин. аблиц Реконструкция поврежденных мембран эндоплазматического ретикулума фосфолипидными препаратами0 состоянии функциональной активно-. сти поврежденных мембран судили по скорости окисления субстратов цитохрома Ранилина и аминопирина, Для изучения включения предлагаемого средства на скорость гидроксилирования анилина и диметилирования аминопирина испольэовали микросомы, поврежденные ф А 2Из табл. 3 видно, что в поврежденных микросомах скорость окисления обоих субстратов снижена. Инкубация поврежденных ФАг микросом с укаэанным средством приведена к увеличению скорости окисления субстратов, что свидетельствует о восстановлении функциональной активностиповрежденных мембран эндоплаэматического ретикулума.Скорость окисления анилина и аминопирина в микросомах печени крыс, поврежденных фосфолипазой А 2 и инкубированных с суспенэией ФХхл 1. ГК (нмоль) образовавшегося продукта в мин, мг белка приведена в табл,4.Формула изобретения Средство для реконструкции мембран 10 1 п чтго, содержащее фосфатидилхолинхлопчатника и аетергент, о т л и ч а ю щ е ес я тем, что, с целью повышения репарационной активности, в качестве детергента используют тринатриевую соль глицирриэи новой кислоты при соотношении фосфатидилхолин: детергент 1.0,1-0,2.1747072 Таблица 3 Микросо кубаци Ххл - ГК О+0,5 лица 4 П ча оставитель С,Мельниковехред М.Моргентал Корректср Н.Ко дактор А,Долйнич Тираж Подписнэе ного комитета по изобретениям и открытиям 035, Москва, Ж, Раушская наб 4/5 ри ГКН роизводственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 Закаэ 2453 ВНИИПИ Государстве е: Инкубацию микросом, обработсуспензией проводили на 3 мл суспензии на 1 нмоль цитохро 1 ч при 4 С. н:лх ФА 2, сосфолипиднойРв течени