Способ получения 9 -гидроксиандрост-4-ен-3, 17-диона

(5)5 С 12 Р 33/О ЯР РурвЧ)ц,иьлчзта ПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕН К АВТОРСКО ВИДЕТЕЛ ЬСТВ тер Атрат, Пет Калейс, Хельму гитт Готтшаль О) НИ) 9 а -ГИДРОК".-ДИОНАится к микробиолоости. и может быть изводстве стероидсредств. Цель изоие способа, Для используют штамм ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯПРИ ГКНТ СССР(57) Изобретение относгической промышленниспользовано при проных фармацевтическихбретения - ускореносуществления способа Бюл. М 44е предприятие "Йенафарм Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается способа микробиологического получения производных андростана из стеринов, которые являются важными промежуточными продуктами в частичном синтезе стероидных фармацевтических средств.Известен (см.описание к патенту ДЕ-АЯ 2647895 или относящиеся к тому же предмету параллельное описание к патенту ОО 127455) микробиологический способ получения 9-ОН-АД из стеролов, в котором используется, депонированный как под номером регистрации ИВЯ В, так и под номером регистрации ОЯМ 752 микроорганизм вида МусоЬас 1 егцп) 1 огвтоп) . Избирательное превращение стерола в МусоЬассегоа 1 ог 1 цмщ ЛМЕТ 10849, Ферментацию проводят в присутствии тонко диспергированного полимера полиамида 6, полиамида 11 или циклогексанон-формальдегид-конденсационной смолы в концентрации 10 г/л среды. При этом как трансформируемый стерин, так и полимер могут быть введены в культуральную среду на разных этапах ферментации как вместе, так и порознь, а процесс трансформации проводят либо в питательной среде, либо в фосфатном буфере. Для получения целевого продукта используют как один из стеринов, так и их смесь. Во всех случаях получено повышение выхода целевого продукта по сравнению со способами трансформации в отсутствие полимера. 2 з.п, ф-лы, 1 табл. указанный целевой продукт происходит при этом в аэробных и стерильных условиях культивирования в водных питательных средах, содержащих источники углерода и азота, а также минеральные соли, причем превращаемый стерол используется в концентрации, например, 10 г/л.Ввиду нерастворимости в воде и высокой гидрофобности стеролов (как сито-, арго-, кампо-, холе-, и стигмастерол) эти вещества обладают лишь незначительной биологической доступностью, что в соответствии со специфической трансформационной способностью используемого микроорганизма ведет к большой продолжительности культивирования - до 15 сут. После представления технического реше 169464410 15 20 25 30 35 40 45 50 55 ния согласно патентному описанию ОЕ-АЯ 2647895 сделано немало попыток, чтобы при помощи направленных добавок в ферментационную среду повлиять на биодоступность стеролов и тем самым увеличить общую скорость превращения и выходы, устраняя хотя бы один из неблагоприятных аспектов указанного выше технического решения. В качестве таких добавок используют органические растворители, определенные неионогенные поверхностно-активные вещества, а также специальные компоненты питательных сред (см., например КезсЬ К. Всегоб сопчегзопз. В кн. А.НЯозе (Еб.) МсгоЫа еп 2 упчез апб Ьосопчегзопз. Есоповс МсгоЫооду, 5 (1980), 370 - 467.,Асабеп 1 с Ргезз;опбоп, йечч,ой, Тогопто, Зубпеу, Яал Ггапсзсо).Добавки органических растворителей даже в низких концентрациях оказались неприемлемыми из-за своего токсического действия.Добавки неоиногенных поверхностно- активных веществ и/или продуктов, которые одновременно можно рассматривать как компоненты питательных сред, сильно затрудняет переработку ферментационных сред, в частности экстрагирование производных андростата, как целевых продуктов, если их прибавляют в высоких концентрациях, необходимых для полного превращения стерола.Цель изобретения - ускорение способа.Для осуществления способа используют штамм МусоЬастегйв тогозмт й 10, депонированный в Центральном институте микробиологии и экспериментальной терапии под номером 7 МЕТ М 10849, который характеризуется следующими признаками,Микроорганизм М.Фогтотцгл 2 МЕТ 10849 относится к быстрорастущим микроорганизмам, а согласно ВУ ч. 10 М - к группе нефотохромогенных микобактерий.На пластинках агара образует белые или кремового цвета колонии, пигмент не образует даже в условиях 14-дневного непрерывного искусственного освещения, Для штамма характерен полиморфизм. При выращивании на агаре развиваются переходные формы: тонкие палочки, короткие палочки, коксовидные. Часто палочки имеют на одном конце набухшую конфигурацию. В жидкой питательной среде в условиях перемешивания образует сферические относительно плотно упакованные клеточные агрегаты, Отдельно располагающиеся клетки в препаратах наблюдаются редко,Штамм трансформирует Р-ситостерин в 9 а-гидроксиандростендион.Для физиологической характеристики штамма применяют показатель производительности ациламидного обмена,Штамм имеет высокую ацетамидазную,уреазную и аспарагиназную активность. Пиразинамид и аллантоин расщепляют в незначительной степени. Способ осуществляют следующим образом.Штамм выращивают в пробирках на глицерин-агаровых косяках в течение 3 - 4 дней при 35 С, Питательная среда имеет следующий состав: 2% глицерина, 0,5% пентона, 0,3% мясного экстракта, рН 7,0. В 500-миллиметровые круглодонные колбы помещают питательную среду Н 10/1, содержащую 0,1% (чН 4)Н 2 Р 04, 0,1% (ИН 4)Н 2 Р 04, 0,2% КН 2 Р 04, 0,5% глицерина, 1% дрожжевого экстракта, 10 мл раствора микроэлементов (0,2% Н 2304, 0,1% ИаС, 0,05% Ее 304 7 Н 20, 0,05% Еп 304 7 Н 20, 0,5% МдЯО 4 ЗН 20, 0,005% Со 3045 Н 20, 10 мл 0,1 Н 2304 нд 1 л Дистиллированной ВОДЫ),10 г полиамида 11 с размером частиц 5 - 300 мкм, 10 г соответствующего ситостерина, 1 л дистиллированной воды, рН среды 7,0, засевают культурой МЛогтойцтп. Ферментацию ведут в течение 2 - 6 дней В отношении введения полимера и стеринового субстрата способ осуществляется по нижеследующим вариантам Полимер используют во время выращивания в присутствии трансформируемого субстракта, т.е. приготовленный субстрат из трансформируемого стерина илисмеси стеринов прибавляют к ферментационной жидкости в начале выращивания в концентрациях от 1 до 50 г/л, предпочтительно 10 г/л. Культуральную жидкость ферментируют при рН 6 - 8 при температуре 26 - 35 С. предпочтительно 28 С.По окончании ферментации целевой йродукт отделяют, выделяют органическим раст.ворителем,Полимер используют во времени выращивания в отсутствие трансформируемого субстракта, т.е. приготовленный субстрат прибавляют к ферментационной жидкости после 1 - 36-часового (предпочтительно 24- часового) культивирования с полимером, ферментацию проводят аналогично описанному выше.Полимер используют во время выращивания культуры в отсутствие трансформируемого субстрата стерина, т.е. штамм выращивают в питательной среде в присутствии полимера в течение 12 - 36 ч, а затемперед проведением трансформации биомассу и полимер отделяют от питательной среды осаждением. Стериновый субстрат перемешивают с полученным осадком и суспендируют в буферном растворе, процесс проводят так, кэк описано в первом варианте,В качестве тонко диспергированного твердого гидрофобного органического полимера используют циклогексанонформальдегид-конденсационную смолу, например а, полиамид 6, или полиамид 11,В качестве трансформируемого субстрата используют сито-, эрго-, компе-, холе- или стигмэстерин либо смесь из этих стеринов, Продолжительность ферментации предпочтительно 4 дня, для экстракции целевого продукта используют бутилацетат.Трансформацию стеринэ (по третьему варианту) проводят предпочтительно в 0,01- 0,1 М фосфатном,буфере.Использованием полимерной добавки (независимо от стадии введения последней) достигается повышение выхода целевого продукта (9-0 Н-АД).В таблице приведены сравнительные данные по выходу 9 -гидроксиандрост-ен,17-диона (9-0 Н-АД),П р и м е р 1. Двадцать 500-миллилитровых плоскодонных колб с 50 мл питательной среды, содержащей, г: дрожжевой экстракт 10, глицерин 10, КН 2 Р 04 0,5: К 2 НР 040,5; (й Н 4)Н Р 04 1,5; М 9504 7 Н 20 0,2; Ее 502 7 Н 20 0,01; Лп 304 7 Н 20 0,02, поли- амид 11 - 0,5, ситостерин 0,5, и 1000 мл дистиллированной воды (рН 7), засевают 5 мл 48-часовой культуры штамма М. огтщшв И 10. Дальнейшее культивирование осуществляют при 20 С на круговой качалке, после 48-часовой ферментации отделяют оттвердой фазы, экстрагируют бутилацетатом и выделяют 9-0 Н-АД, Получают 5 г 9-0 Н-АД, что в сравнении с прототипом соответствует увеличению выхода на 40 ,П р и м е р 2. М. 1 опв 1 оа М 10 культивируют в соответствии с примером 1, но в качестве полимера используют полимид 6. Выход 9-ОН-АД составляет 4,0 г.П р и м е р 3, Осуществляют способ в соответствии с примером 1, но в качестве полимера используют циклогексанон-формэльдегид-конденсэционную смолу ( а - 2). Выход целевого продукта 4,5 г,П р и м е р 4. Способ осуществляют с примером 1, но используют смесь стеринов, состоящую из 55 о р -ситостерина, б - кампестерина и 39 остигмастерина. Выход целевого продукта 5,3 г.П р и м е р 5. Способ осуществляют в соответствии с примером 1, но в питательную среду вносят 0,5 г полиамида 11 (зернистость(100 мкм) без добавления5трансформируемого субстрата. После культивирования смесь полимеров и культурыотделяют центрифугированием и прибавляют по 0,5 г смеси стеринов (пример 4), ферментируют в течение 48 ч и после этоговыделяют целевой продукт. Выход 5,5 г.П р и м е р 6. В 20 плоскодонных колбемкостью 500 мл с 50 мл питательной средыдобавляют по 0,5 г полиамида 11, засеваютпо 5 мл суспензии 48-часовой культуры М.1 огтойов К 10 и культивируют в течение 24ч при 28 О С на круговой качалке. Для трансформации стерина биомассу с полимеромотделяют и по 2,5 г помещают в колбы емкостью 500 мл, содержащие по 50 мл фосфаткого буфера по зеренсену, рН 8,0. В колбывносят по 0,5 г смеси стеринов (пример 4) ипомещают нэ круговую качалку. Через 96 чинкубирования выделяют целевой продукт,Выход 9-ОН-АД 4,0 г,25П р и ме р 7, Трансформацию проводятв соответствии с примером б, но в качествеполимера используют циклогексанон-формальдегид-конденсационную смолу (а - 2),Выход целевого продукта 3,3 г,П р и м е р 8. Способ осуществляют попримеру б, но используют полиамид б, Выход целевого продукта 2,7 г,Формула изобретения35 1. Способ получения 9 а - гидроксиандрост-ен,17-диона путемтрансформации субстрата в процессе ферментаций штаммаМусооаИепощ 1 опиЫцв ваэробных условиях в жидкой питательной40 среде, содержащей источники азота и углерода и минеральные соли, с последующимвыделением и очисткой целевого продукта,о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с цельюускорения способа, трансформациюсубстрата осуществляют с помощью штамма МусоЬаИегоа 1 огтосигп 21 МЕТ 10849, аферментацию ведут в присутствии тонкодиспергированного полимера полиамида 6,полиамида 11 или циклогексанон-формаль 50 дегид-конденсационной смолы в концентрации 10 г/л среды.2, Способ по п.1, о тл и ч а ю щи й сятем, что полимер вносят в питательнуюсреду одновременно с субстратом.3. Способ ПО и. 1, О т л и ч э ю щ и Й с Ятем, что культуру подращивают вприсутствии полимера, затем смесь полимера и биомассы отделяют от культуральной,среды, смешивают с субстратом итрансформацию ведут в фосфатном буфере.,1694644 ставитель Г.Смирноваред М.Моргентал Редактор М.Петрова Тех Корректор, М,Кучерявая оизводственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина, 101 аказ 4658 Тираж 350 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ ССС 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5