Способ определения ванилилминдальной кислоты в моче

объеме 0,5 мкм наносят аппликатором ца заранее смоченную в пиридццацетатном буфере (пиридин/уксусная кислота/ /вода 3,5/16/980,5 (Ч/Ч) ацетатцеллюлозную пленку (катодная аппликация), Одновременно с пробами на пленку наносят и стандартный раствор В 11 К в концентрации 100 мкг/мл. Электрофорез проводят в пиридинацетатном буфере указанного вьш.е состава при постоянном напряжении 200-220 В в течение 18-25 мин при комнатной гемпературе, По окончании электрофореза пленку сушат в струе теплого воздуха (фец,),15 опрыскивают раствором диазотировацного п-цитроацилина, сушат в струе теплого воздуха и сканируют ца децитомечре (фирма Вес(кшаа). Для при"отовлецця красителя берут: а) 0,1 Е- цьш раствор и-нитроапилина (0,5 г и-цитроацилпна растворяют в 10 мп концентрированной НС 1, объем новост до 0,5 ( полей),; б) 0,27-ный раствор МаИО, в) 107,.-цьэй растворСО ,цепосрепственно перед упот:" пем готовят смесь: 1 объем (а)+,;съем (б), через 4-5 мпн - 2 объа (в); смесь гопна 1-2 мин.Фракция ВИК при проведении электроорезз в данных условиях, как и в мели е (оирмы "Но 1 епа", движется к анопл и образует при окрашивании темцоФиочетовую полосу, перпендикулярную .ац," влеццю электрофореза на расстоянии 3 см от линии старта. Однако засчет ээредварительцой экспертизы числоополцительцых фракций в электрофорег" рамме каждого образца уменьшается.При использовании ацетатцеллюлоэ 40 ных пленок фирмы Вес 1 сшап коэффициент вариации составляет 8,67, потери стандарта после проведения электрофореза 24,27 после экстракции и последующего растворения в воде - 29,07,45При денситометриц максимальная оптическая плотность фракций В(1 К была получена с использованием светоФильтра с длиной волны 550 нм. Ли 50 нейность сохраняется в пределах 2000 мкг/мл.Аналогичные данные были получены при использовании отечественного аппарата для электрофореза на ацетатцеллюлозных пленках ЭПАУ - 20-50 55 (н о гечественных ацетатцеллюлозных (и. ецках (,Фирма Тасма., Казань), Коэф ,г цар эа:пп( дэ(п эгих условий сос та.эляет 9,27., линейность 3030 мкг/мл, потери стандарта после электрофореза 27,27,. Для проведения скзнцрования можно использова.ь интегрирую(дий денситометр из комплекта аппаратуры Биан (Красногвардеец, Ленинград).Расчет количества В 11 К проводят по ФормулеА х 100l ,мг/сутки) ---- х8 х 20 х 0,71х диурез,где А - относительная площадь (7) пика пробы на денситограмме;В - относительная площадь (7)пика стандарта на денситограмме;0,71 - потери при проведении экстракции;20 - коэффициент концентрирования;пиурез - в литрах,гСодепжание ВИК в моче в норме до75 и/сут.Способ поясняется следующими при .мерами.П р и м е р 1. Ацетагцеллюлоэнуюпленку 90 х 90 мм (фирма Тасма, Казань) замачивают в пиридинацетатномбуфере. Готовят стандартные растворыВ 11 К в воде концентрацией 30;40;50;75 и 100 мкг/мл. Стандартные растворынаносят аппликатором на подсушенную наца Фильтровальной бумаге пленку.Электрофорез проводят при постоянном напряжении 200 В, при комнатнойтемпературе в течение 20 мин в пиридинацетатном буфере. По окончании,электрофореза пленку высушивают в струетеплого воздуха и окрашивают свежепри"готовленным раствором диазотированного и-цитроанилина. Электрофореграммусканируют на денситометре Вес 1 вап.Коэффициент вариации метода по стандаг)(нь(м растворам составил 8,67,П р и м е р 2. Больная О., 30 лет(ИБ1193.-3925). Диагноз - симптомаэтическая гипертония (феохромоцитома).1 злобы: оловная боль, боли в области сердца, головокружение, учащенные ночные мочеиспускагия (2-3 раза/ночь), потливость, подъем АД до260/170 мм рт,ст. В промежутках мегдукрцз;лш А 130/80 мм ртст, при аорто-.ВМК мкг мл сло паентов Новь Прототип т мет,0-5,0 Т 2;0 1,7-61,2 20,0 ,8-3,2 6 0 15 2 0 обрет 0 ф и у л ого анализх фракцийппенного со При пров фракция ВМК отделилась, жация ВМК в едении от сос а и орном анадистиллии по раз пробе, з вели лизе мочу 5 16846графин обнаружена гиперваскулярнаяопухоль левого надпочечника (феохромоцитома), При МР-томографии: в проекции левого надпочечника и несколь 5ко ниже определяется дополнительноеобразование округлой Формы, неоднородное по структуре, 3,7 х 2,5 хх 4,1 см (Феохромоцитома).При проведении анализа на БМК 1 О(диуреэ 1250 мл) к 1 мп мочи (рН доводят до 1,05 н. НС 1) добаьляют 1 млнасыщенного раствора ГаС 1 и 4 млэтилацетата. Пробу встряхивают в течение минуты, дают отстоять. я в течецие 20 мин, сргани ескнй слой отсасывают в другую пробирку, экстракцию этилацетатом проводят дважды,Органичес.кий спой объединяют и вы -паривают в вакуумном сушильном шкафу 20Экстракт растворяют ц 50 мкл дистиллированной воды. Р 4. Пробы в объеме0,5 мкл наносят аппликатором ца заранее смоченную в пирндцнацетатном буфере (пиридин/уксусная кислота/вода 3,5/16/980,6 Ч/Ч) ацетатцеллюлозную пленку (катодная аппликация), Одновременно с пробами на пленку наносят и стандартный растворВМК в концентрации 100 мкг/мл, Электрофорез проводят в пиридинацетатцомбуфере указанного выше состава припостоянном напряжении 220 В в течение 20 мин при комнатной температуре.По окончании электрофореза пленку сушат в струе теплого воздуха (Фен),опрыскивают раствором диазотированного п-цитроанилина, сушат в струе теплого воздуха и сканируют на денситометре, Для приготовления красителя 40берут: а) 0,1 -ный раствор и-нитроанилина (0,5 г и-нитроанилина растворяют в 10 мл коцц,НС 1, объем доводят до 0,5 л дистиллированной водой);6) 0,2 -ный раствор ИаИО, в) 10 -ный 45раствор К СО, непосредственно передупотреблением готовят смесь: 1 объем(а) + 1 объем (б), через 4-5 мин2 объема (в), смесь годна в течение1-2 миц. Сканирование проводят придлине волны 550 нм в направлении, поперечном движению Фракций через пробы и стандарты одновременно,756ровацной ведой, Содержание ВМК ц моче - 24,6 мг/сут (Феохромоцитома).После операции - левосторонцяя адреналэктомия по поводу Феохромоцитомы левого надпочечцика (операция по витальным показаниям). Содержание ВМК в моче (диуреэ 980 мл) составило 5.6 мг/сут.П р и м е р 3. С помощью предлагаемого способа быпи обследованы следующие группы пациентов:А - больные с артериальной гипертонией;Б - больные с симптоматической гц;ертонией (феохромоццтома);В - практически здоровые лица.Результаты представлены в таблицг. При рассмотрении полученных данных ц- обходимо учитывать, что по прототипу норма составляет 1-7 мг/л В 11 К без учета диуреза, по нашему методу - до 7,5 мг/сут с учетом диуреза.Таким образом, из всего представленного материала следует, что предложенный способ позволяет количественно оценивать содержание ВМК в моче, тогда как по способу-и;.ототипу возможна только качественная оценка экскреции ВМК. Это дает воэможность проводить уточнение диагноза сиптоматической гипертонии (феохромоцитомы). Экскреция ВИК с мочой в разных группах пациентов Способ определения ванилилминдальной кислоты в моче, включающий микрозлектрофореэ проб и стандартов ца аце татцеллюлоэньм пленках в пиридикацетатном буфере при комнатной температуре и постоянном напряжении с последующей обработкой пленки красителем и оценкой результатов, о т л и ч а ю1684675 Составитель А.АгуреевТехред Л.Сердюкова Корректор Ч,Ревская Редактор А.Маковская Заказ 3502 Тираж 11 одписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР .113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г,ужгород, ул. Гагарина,10 щ и й с я тем, что, с целью повышения точности и информативности способа при исследовании диуреэа, микроэлектрофореэу подвергают экстракт ва 5 нилилминдальной кислоты, полученный из аликвоты суточного объема мочи, на ацетатцеллюлоэную пленку йаносят не менее двух стандартных растворов ванилилминдальной кислоты ввозрастающей концентрации, а оценкупроизводят путем поперечной денситометрии при длине волны 550 нм.