Способ выделения ферментных препаратов аминоацилазы, амилазы и протеаз из aspergillus oryzae

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 9) И 1) С 1 ОБРЕТ ИСА ту ть опанов к ПРЕ- ЛРОферментных ПХ и може цинской, ленностях препаратов и бить использ мической, пи Амил ори эи на вано в меди- евой промышэяйстве,ельском хо меди циЦелью ие проц ием акт ов. зобретения явл са с олновреме ностей фермент ется упрощеным повышех препара СУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОЧНРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР ТОРСНОМУ СВИДЕ(71) Армянский Филиал Всесоюзнонаучно-исследовательского инстихимических реактивов, особо чисхимических веществ и реактивовхроматографии и Всесоюзный научисследовательский институт генеи селекции промышленных ьякроорнизмов(56) Степанов В.М. и др. Выделеи характеристика ацилаэ -аминолот иэ Аэрег 11 ыэ огугае. Биохи1983, т. 48, 370-379.Авторское свидетельство СССРМф 1265216, кл. С 12 И 900, 198(54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ФЕРМЕНТНЫХПАРАТОВ АМИНОАИИЛАЗЫ, АМИЛАЗЫ ИТЕАЗ ИЗ АБРЕКС 1 Ь 1.1)Б ОКУЕАЕ Изобретение относится к технической микробиологии, касается получени(51) Иэобретение относится к техничекой микробиологии, касается получения ферментных препаратов из амилоризина ПХ и может быть использованов медицинской, химической, пищевойотраслях промышленности, сельскомхозяйстве. Целью изобретения являетсупрощение процесса с одновременнымповышением активностей Ферментныхпрепаратов . В качестве исходного сырья используют Амилориэин ПХ или поверхностную культуру его продуцента,а ракционирование водных экстрактовосуществляют спиртами или сульфатомаммонил. Интервалы процентного содержания спиртов, при которых выпадаютв осадок ферментные препараты: 35452 для выделения протеаэы, 45-503для выделения аминоацилаэы и 72-757для выделения амилаэы. Для осажденияэтих ферментных препаратов сульфатомаьюония требуется соответственно 50,60 и 807. насыщения. Изобретение заключается в том, что в качестве исходного сырья используют Амилоризин ПХ или поверхностную культуру его продуцента, а Фракционирование водных экстрактов осуществляют спиртами или сульфатом аммония.Интервалы процентного содержания спиртов при которых выпадают в осадок ферментные препараты: 35-403 для выделения протеаэы, 45-503 для выделе т ния аминоацилаэы и 72-753 для выпеле 1654335ния амилаэы. Для осаждения этих Фер. ментньм препаратов сульфатом аммония -требуются соответственно 50%, 60% и 80% насыщения.П р и м е р 1. Ферментные препараты выделяют из высушенной культуральной массы А.отукае, наделенной следующими активностями, ед./г: амилолитическая 160; протеолитическая 2,3; аминоацилазная 40 ед/г, Этот препарат выпускается под названием Амилориэин ПХ.В литровую трехгорлую круглодонную колбу, снабженную мешалкой, термомет ром и капелькой воронкой, помещают 30 г Амилориэина ПХ, добавляют 200 мло дистиллированной воды и при 25 С, рН 7,0 и перемешивании осуществляют экстракцию в течение 2 ч. Значение рН поддерживают. добавлением 2 н, водного раствора гидроокиси натрия. Затем Фильтруют на воронке Бюхнера. Осадок выбрасывают, а Фильтрат, содержащий ферменты, центрифугируют на центрифу ге при 2 С и 4000 об/мин в течение 20 мин.Супернатант переносят в колбу, охлаждают до 0-1 С и при перемешивании добавляют этанол до получения 40% 30 содержания последнего. Выпавший осадок, представляющий собой препарат протеазы, отделяют центрифугированием в вышеуказанных условиях, растворяют в минимальном объеме воды и сушат лиофильно. Выход препарата по активности 33%, активность 26 ед/г.Супернатант переносят в колбу и в описанных условиях добавляют этанол до получения 50 содержания спирта. 40Выпавший осадок, представляющий собой препарат аминоацилаэы, отделяют и сушат, как описано выше. Выход продукта по активности составляет 78%. Аминоацилаэная активность равна45 720 ед/г.Супернатант после выделения Ферментных препаратов протеаэы и аминоацилаэы переносят в колбу и в описанных условиях добавляют этанол до 75% содержания последнего. Выпавший осадок -амилолитический препарат отделяют и сушат, как описано выпеВыход препарата по активности 76%, Амилолитическая активность равна 4000 ед/г.Супернатант, представляющий собой5575%-ный раствор этанола, содержащий низкомолекулярные белки, пептиды и аминокислоты, подвергают перегонке в вакууме при 50-60 ОС досуха. Этанолиспользуют повторно для той же цели.Осадок, содержащий 53% аминокислот,в том числе незаменимые аминокислоты,валин, триптофан, лейцин, Фенилаланин, используют для получения балансированных кормов.П р и м е р 2. Процесс проводятаналогично примеру 1 с той разницей,что в качестве осадителя используютизопропиловый спирт, конечные концентрации которого соответственноравны: 35% при выделении протеазы,45% аминоацилазы и 75% - амилазы.Активности Ферментных препаратовпротеаэы, аминоацилаэы и амилазы составляют 20, 220, 1650 ед/г, а выход26, 53 и 59% соответственно,П р и м е р 3. Процесс проводятаналогично примеру 1 с той разницей,что в качестве осадителей Ферментныхпрепаратов используют сульфат аммония. Препараты перед лиофильной сушкой подвергают диализу против холодной дистиллированной воды.В 20-литровый стеклянный аппаратмарки Ящах, снабженный линией дляохлаждения рассолом, мешалкой и термометром, помещают 10 л водного экстракта, полученного из 1,5 кг Амилоризина ПХ. Пускают в ход мешалку ипри рН 7,0 и температуре 2 С небольшими порциями добавляют сульфат аммония до получения 50% насыщения последнего и оставляют при 2-5 С в течение16 ч. Выпавший осадок отделяют центрифугированием при 3000 об/мин, растворяют в минимальном объеме воды и переносят в целлофановую пленку (сосисочную) и осуществляют диализ противхолодной воды до полного удалениясульфат-иона. Отсутствие сульфат-ионапроверяют 20% хлористого бария. Содержимое диалиэиого мешка сушат лиофил ьноПротеолитическая активность Ферментного препарата 29,0 ед/г. Выходпо активности 23,0%.Супернатант переносят в аппарати в описанных условиях добавляютсульфат аммония до получения 60% насьпцения последнего.Отключают мешалку и оставляют при2-5 С в течение 16 ч.Выпавший осадок, представлякипийсобой ферментный препарат аминоацилазы, подвергают диализу и сушат лио-.фильно, как описано выше.5 165433Аминоацилазная активность препарата 850 ед/г. Выход продукта по актинности 857.Супернатант после выделения аминоацилазы переносят в аппарат и при опи санных условиях продолжают добавлене до получения 807. насыщения сульфатом аммония. Отключают мешалку и содер)имое аппарата оставляют при 2-5 С в тео10 чение 16 ч.Выпавший осадок, представляющий собой ферментный препарат амилазы, отделяют, подвергают диалиэу и лиофильно сушат, как описано вьше.Амилолитическая активность препарата 12000 ед/г, Выход продукта по активности 217.П р и м е р 4. Процесс проводят аналогично примеру 3 с той разницей, 70 что высушивание ферментных препаратов осуществляют этанолом непосредственно после осаждения, минуя стадию диализа.Для этого мокрые ферментныпрепа-, раты из центрифужных стаканов перено сят н гомогениэатор, добавляют охлажденный до минус 8-10 С этанол из расчета 25-30 мп на 10 г препарата и гомогенизируют н течение 3-5 мин. Фильтруют на воронке Бюхнера и сушат на воздухе в течение 10-12 ч.Акти ность ферментных препаратовпротеазы, аминоацилаэы и амилаэы составляет 19,0, 587; 1000 ед/г, а выход 29, 71, 257 соответственно.П р и м е р 5. Процесс осущестнля35ют аналогично примеру 1 с той разницей, что ферментные препараты получают в промышпенньм условиях из водного экстракта биомассы А,огукае, нь)ращенной поверхностным способом. Экстракцию проводят водопроводной водой,осаждение осуществляют непрерывнопри 7-12 ОС, препараты выделяют на сепараторе-кларификаторе при 4,70 об/мин 45и после лиофильной сушки подвергают дроблению.В экстрактор емкостью П)0 л, снабженный механической мешалкой, помещают 120 кг биомассы А.огукае влажностью 403, выращенной на пшеничных отрубях добавляют 450 л водопроводной воФоды с температурой 30 С, пускают вход мешалку и осуществляют экстракциюв течение 1 ч, Затем насосом экстрактподают на фильтр-пресс, где осуществляют отделение биошрота от вытяжки.Вытяжка поступает н напорный бак длязагрязненной вытяжки, отхлаждается 5 6до 5 ОС и оттуда поступает на центрифугу, где при ЗОЭ) об/мин очищаетсяот взвешенных частиц.Очищенная вытяжка поступает в напорный бак очищенной нытяжки и оттуда через ротаметр н смесительнуюколонну диаметром 7) мм, высотой1000 мм. В эту же колонну из другогонапорного бака через холодильник идругой ротаметр поступает этиловыйоспирт с температурой минус 10-12 С.В смесительной колонне экстрактнепрерывно смешивается с этанолом,при этом часть ферментов, присутствующих н экстракте, выпадает в осадок. Процентное соотношение этанолан отходящей водно-спиртовой смесисоставляет 407. Осаждение происходитпри 11-12 С. Суспензия ферментов в. оводно-спиртовой смеси из смесителянепрерьнно поступает на сепараторкларификатор, где при 4170 об/минотделяется от последней,Осадок, представляющий собой ферментный препарат с протеаэной активностью, выгружают иэ сепаратора-кларификатора на раскладочный стол, затем на кюветы. Кюветы с препаратомустанавливают н камеру морозильногофстола и эамораживают до минус 3 С.Затем препарат сушат н течение 1014 ч н сублимационной сушилке маркиКСдо температуры продукта 20 ССухой препарат протеазы выгружаютиз сублимационной сушилки и подвергают дроблению на дробилке маркиДДК-ЗЬ.Протеолитическая активность ферментного препарата, названного Проторизин, равна 31 ед/г. Выход препарата по активности составляет 453.Водно-спиртовой раствор посленьщеления ферментного препарата поступает в другой напорный бак, снабженный змеевиком, линиями рассола и воздуха, где при перемешивании воздухомохлаждается до 3-5 С. Из этого напорного бака водно-спиртовая смесь черезротаметр поступает в смесительную колонну, где подвергается осаядению.Осаждение ферментов, их ныделение,сушка и дробление осуществляются, какописано выше. Температура осажденияосоставляет 8-10 С, а содержание этанола в смеси 5)Х.Ферментный препарат обладает аминоацилазной активностью, равной650 ед/г. Выход по активности 761.1654335 Составитель В.ВарламовТехред Л.Олийнык Корректор А.Обручар Редактор Н. Гунько Заказ 1930 Тираж 372 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Иосква, Ж"35, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина, 101 Водно-спиртовой раствор после выделения Ферментных препаратов протеаэы и аминоацилаэы поступает в напорный бак и оттуда, охлажденный до 3- 5 С, через ротаметр поступает в смесительную колонну и подвергается осаждению. Осаждение ферментов, их выделение, сушка и дробление осуществляются, как описано выше. Температура осаждения 7-8 С, а содержание спирта ,в смеси 723.Амилолитическая. активность препарата составляет 6000 ед/г. Выход по активности 823.15 ,Формула изобретенияСпособ выделения Аерментных препаратов аминоацилаэы, амилаэ и проте аз из Азрег 8 д 11 из огувае, включающийводную экстракцию исходного сырья,фракционирование спиртом или сульФатом аммония и сушку препаратов,о т л и ч а ю щ и й с я тем, что,с целью упрощения процесса с одновременным повышением активностей Ферментных препаратов, в качестве исходного сырья используют АмилоризинПХ илй поверхностную культуру егопродуцента, а при Аракционированииспиртом устанавливают концентрации:35-403 для выделения протеазы, 45-503для аминоацилазы, 72-753 для амилаэыили 503, 603 и 803 насыщения соответственно при фракционировании сульфатом аммония.