Способ выделения амилазы из препарата амилоризин

(.ОЦИЛЛИСТИЧЕСКИРЕСПУБЛИК 807080 19) П 5)5 С 12 М 9/ ЗОБР ТЕНИ ВТОРС КОМУ СВИД ЬСТВ фармацев- получения ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕВЕДОМСТВО СССР(71) Ташкентский государственный университет им. В.И.Ленина(56) Авторское свидетельство СССР(54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ АМИЛАЗЫ ИЗПРЕПАРАТА АМИЛОРИЗИН(57) Использование: медицина итическая промышленность для Изобретение относится к технической биохимии и биотехнологии, а именно к способам очистки ферментов, и может быть использовано в медицине и фармацевтической промышленности для получения чистых препаратов,Цель изобретения - ускорение и упрощение способа и повышение активности целевого продукта.Изобретение заключается в том,.что амилазу перед осаждением сульфатом аммония центрифугируют, а затем подвергают иоспецифическойочистке Р сорбенте с инкубацией в буферном растворе.Для биоспецифической очистки используют сорсилен импрегнированный сывороточным бычьим альбумином, биоспецифическую очистку проводят с использованием 0,05 М раствора универсального буфера с рН 3,5, инкубацию проводят в течение 20-30 мин при 4-6"С.Новым в предлагаемом изобретении является применение биоспецифического разчистых препаратов. Сущность изобретения: амилоризин растворяют в 0,05 М универсальном буферес рН 3,5. Иэ раствора удаляют протеаэы биоспецифической очисткой, Для этого вносят 30-40 мг/мл сорсилена, импрегнированного бычьим сывороточным альбумином, инкубируют смесь 15-20 мин при 4-6 С. Затем проводятосаждение амилазы сульфатом аммония и ее очистку ионообменной хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе. Удельная амилолитическая активность препарата 3615 ед/мг белка выход по активности 92%. деления в качестве первой стадии очистки, позволяющей полностью избавиться от примесей протеаз;Существенные отличия способа заключаются в четырехстадийном получении амилазы (вместо пяти стадий).ейййП р и м е р 1. Готовят 150 -ный раствор СО ферментного препарата амилазы С) Аэрегдйоэ огугае из амилоризина Г 10 х в 0,1 сМ в универсальном буфере рН 3,5, Нерастворившиеся частицы удаляют центрифуги- цр рованием в течение 20 мин при 6000 об/мин и к супернатанту добавляют сорсилен, импрегнированный бычьим сывороточным альбумином БСА) до конечной концентрации Мак 30-40 мг/мл. После 20 мин инкубации при а 4-6 С смесь центрифугируют и отделяют супернатант. Затем ферментный раствор подвергают высаливанию 807 б сульфатом аммония от насыщения и подвергают ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлю- лозе Сорсилен. импрегнируеиый альбумином, получают по известной мето1807080 аемый способ оказатель 0 час 1,5 час 10289220 3615,0 2400300 30,0 195,0 след 0,06 92 1,0 82 3,2 дике, Степень очистки составляет 120 рэз, Удельная амилазная активность 289220 ед,/г,П р и м е р 2, Все операции проводят, как в примере 1, но конечная концентрация сорсилена БСА составляет 10 мг/мл. Степень очистки составляет 40 раз. Удельная амилазная активность 96120 ед./г.П р и м е р 3. Все операции проводят, как в примере 1, но конечная концентрация сорсиленэ, импрегнированного БСА, составляет 20 мг/мл, Степень очистки составляет 80 раз, Удельная активность 192210 ед./г,П р и м е р 4. Все операции проводят, как в примере 1, но конечная концентрация сорсилена в импрегнированном БС А составляет 50 мг/мл, Степень очистки составляет 110 раз. Удельная амилазная активность 264330 ед./г,П р и м е р 5. Все операции проводят, как в примере 1, с использованием 0,03 М универсального буфера. Степень очистки составляет 100 раз, Удельная амилазная активность 240300 ед./г.П р и м е р 6. Все операции проводят, как в примере 1, но с использованием 0,1 М универсального буфера. Степень очистки составляет 110 раз. Удельная амилазная активность 264330 ед,/г.П р и м е р 7. Все операции проводят, как в примере 1, инкубацию в универсальном буфере проводят в течение 10 мин, Сте 1. Длительность процесса 2. Число стадий 3. Температура проведения процесса, С 4, Содержание белкав целевом продукте,5. Активность по ГОСТ 20264.4-74, ед/г По Бернфельду, едlмг 6, Остаточная протеолитическая активность ГОСТ 20264, 2-74, ед/г по Ансону, ед/г 7, Выход: по активности, ф по белк, пень очистки составляет 100 раз. Удельнаяактивность 240300 ед./г.Из представленных выше примероввидно, что оптимальными условиями для .5 удаления протеиназ являются: инкубация сбиосорбентом при концентрации последнего 30-40 мг/мл в буфере ионной силой 0,05М в течение 15-20 мин.В таблице представлены сравнитель"О ные характеристики полученной амилазы.Таким образом, предлагаемый способобладает следующими преимуществами: сокращается число Операций, повышаетсястепень очистки, снижается протеазная ак 15 тивность,Формула изобретенияСпособ выделения амилазы из препарата амилоризин, предусматривающийрастворениесырья,удаление протеолитиче 20 ских ферментов из раствора, осэждение целевого продукта сульфатом аммония и егоочистку, отл и ч а ю щи й с я тем, что, с цельюускорения и.упрощения способа и повышения активности целевого продукта, раство 25 рение сырья ведут в 0,05 М универсальномбуфере с р Н 3,5, удаление протеолитическихферментов из раствора осуществляют добавлением сорсилена, импрегнированногобычьим сывороточным альбумином, до кон 30 центрации 30-40 мг/мл с последующим инкубированием смеси в течение 15-20 минпри температуре 4-ба, а очистку целевогопродукта проводят ионообменной хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе,35 Способ по авт. св. й.1214755