Способ получения w-интерферона человека

СОЮЭ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИРЕСПУБЛИК НЫЙ КОМИТЕТ ИЯМ И ОТНРЫТИ ОСУДАРСТВ О ИЗОБРЕТЕ РИ ГКНТ С Е ИЗО ТЕНИ АП:НТУ ь кисло УМВ без аминКас-аминокисВодада(1 л), грожжевой экакт-пептон,Дстракт г Водавнус Ьеи-ра Триптофан Аргинин О 100 мй), г:0,25 0,20 о Гистидин ИзолейцинЛизинМетионин 0,60 0,40 0,10 Фен илан илТреонинАденин 0,5 0,1,(71) Берингер Ингельгайм Интернациналь ГмбХ (1)Е)(53) 575,224.2(088.8) И бретение относится к генетической инженерии и касается получения интерферона.Способ получения -интерферона заключается в том, что трансформированный рекомбинантной плазмидой ДНК рУ ПВ-Нц,1 Р 1 Щ штамм дрожжей СИЗ-С 2 инкубируют, центрифугируют при 5000 я в течение 5 мин, суспендируют в растворе гуанидин хлорида, добавляют стеклянные шарики с последующим встряхиванием, надосадочную жидкость инкубиру- ют и объединяют с раствором промывки стеклянных шариков, содержащим гуанидин хлорид, с последующим центрифугированием при 12000 д в течение 1 мин.В примерах 1,2 используют среды следующего состава, ЮВ+САА- среда .(1 л), г:51)5 С 12 И 15/00, С 12 Р 21/О 2(57) Изобретение относится к генетической инженерии и касается получения интерферона. Способ получения 11-интерферона заключается в том, что трансформированный рекомбинатной плазмндой ДНК=рУ-ЛОВ-Но.1 РЮУ штамм дрожжей СМЗ-С 2 инкубируют, центрифугируют при 5000 я в течение 5 мин, суспендируют в растворе гуанидин хлорида, добавляют стеклянные шарики с последующим встряхиванием, надосадочную жидкость инкубируют и объединяют с раствором промывки стеклянных шариков, содержащим гуанидин хлорид, с последующим центрифугированием при 12000 я в течение 1 мин,(ЭДТУК)Дистиллированная водаДТТ (дитиотрейтол)Стерильная фильтрация.ВСЕ (25 мл), мл2 М сорбит0,5 М цитрат тринатрия0,5 М ЭДТУКСтерильная дистиллированная водаСАБ (25 мл), мл:2 М сорбит100 мМ хлористыйкальций1 М трис; рН 7,5Стерильная дистиллированная водаРаствор ПЭГ (20 мл), мл:Полиэтиленгликольс м,в4000 г100 мМ хлористыйкальций1 М трис; рН 7,5Дистиллированная вода 182 20 7 20 2512,3 1,25 11, 25192 75 30 12,55,00,5 35 12,540 2,50,25 9,7545 20,2 50 17,8 Стерильная фильтрацияЬОС (5.мл), мл:2 М сорбитУРД100 мМ хлористыйкальцийР 2,5 55 0,3 Обрабатывают в автоклаве и охлаждают до 45 С, затем добавляют 50 х минус Ьеи-раствора и изготовляют пластинки. 15 50 х минус Ьеи-раствор, мкл 12,5Дистиллированная вода 0,5Стерильная фильтрация.Способ иллюстрируется следующими примерами.П р и м е р 1, Конструирование плаэмиды рУ-ЛОВ-НцдРЯЫ 1.А. Получение фрагмента промотора АОН 1.80 мкг плазмиды рЕЯ 103 переваривают с ВапН 1 и Хпо 1 эндонуклеазами в 500 мкл раствора. Промотор длиной около 1400 пар оснований (п,о,) отделяют от вектора на 1%-ном агаровом геле, выделяют из геля электроизоляцией и осаждают, Фрагмент поглощают в 40 мкл ТЕ-буфера (10 мМ трис, 1 мМ ЕДТУК, рН=8),Б Подготовка вектора рЛПВ 20710 мкг известной плазмиды рЛОВ 207 разрезают с помощью ВапН 1 в 100 мкл раствора, линеаризуя ее. С целью пред" отвращения последующей религации 5 -концевые фосфатные группы удаляют/путем обработки фосфатазой телячьего кишечника. Линейную форму отделяют на 1%-ном агаровом геле от неразрезанной плазмиды, выделяют электроэлюацией и осаждают. Векторную ДНК растворяют в 20 мкл ТЕ-буфера.50 мкл плазмиды рКНИ 12 линеаризуют с помощЬю Ндпд 111 в б 00 мкл раствора. Путем добавления фрагмента Кленова ДНК-полимеразы 1 (10 единиц) и четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов (по 25 мкм) и инкубации при комнатной температуре 5 -выступающие концы превращают в прямые концы, Линейную форму плазмиды очищают путем электрофореза на агаровом геле и последующего выделения. Фрагмент растворяют в 50 мкл ТЕ-буфера. Для получения соединяющихся с фрагментом прото- тора концов к концам линейного рКНЮ 12 . присоединяют Хпо 1-линкеры, для чего 3 мкл ХЬо 1-линкера (формула йССТССАСС 3) фосфорилируют 5 ед. 14- полинуклеотидкиназы и гАТР; после инактивации энзима нагреванием в течение 10 мин при 70 С 5 мкл этого раствора объединяют с 10 мкл линейной формы плазмиды рКН 1 ч 12; 20 мкл реакционного раствора лигируют с Т 4-ДНК-лигазой 7 (1 б ч при 14 С), Лигазу инактивируют путем обработки в течение 10 мин прио70 С и доводят объем реакционного раствора до 150 мкл добавлением буфе51251 6 5 15ра А (1 О шМ трис, рН=7,6, 50 мМ хлористого натрия, 1 О мМ хлористого магния),Путем обработки 100 ед. Хпо 1 удаляют специфичные относительно ХЬо 1/5 -выступы. Сцабженную ХЬо 1-концамилинейную плазмиду рКНО 12 очищают пу-.тем электрофореза на агаровом геле иэлектроэлюации из геля, Перед осаждением добавляют 5 мкл фрагмента промотора, После осаждения молекулы ДНКпоглощают в 14,5 мкл ТЕ-буфера и после добавления буфера лигирования иБ ед, Т 4-ДНК-лигазы лигируют в течеоние 16 ч при 14 С. После термическойинактивации энзима объем растворадоводят до 200 мкл добавлением упомянутого вьппе буфера А и режут ДНК спомощью ВашН 1. Желаемую ДНК получаюточисткой агаровым гелем и растворяютв 20 мкл ТЕ-буфера.Готовую плазмиду получают лигированием 5 мкл фрагмента ВашН 1 (промотор и ген интерферона М) с 1 мкллинеаризованного вектора р.ШВ В 207в 10 мкл раствора в присутствии 1 ед,Т 4-ДНК-лигазы,10 мкл компенентных клеток штаммаЕ,со 1 х НВ 101 трансформируют путемдобавления 5 мкл раствора продукталигирования и культивируют на ЬВ-агаровых пластинках, содержащих100 мкг/мл ампициллина,Произвольно выбирают 12 из полученных клонов и,выделяют содержащиеся в них плазмиды в малом масштабе(объем культуры 1,5 мл), После обработки этих плазмид с помощью различных рестрикционных энзимов и электрофореэа на агаровом геле выбирают плазмиду, имеющую желаемую конструкцию,и обозначают ее как рУ-ЛПВ-Нц-.1 ГНИ 1.П р и м е р 2. Получение И-интерферона,А.Трансформация дрожжей25 мл УРД + минус Ьец-раствораинокулируют дрожжевой колониейГштамм СМЗ-С 2), Культуре дают растив течение ночи при 30 С. 100 мл УРД++минус Ьец-раствора инокулируют100 мкл полученной предварительнойокультуры и дают расти при 30 С до оптической плотности 1 при 600 нм (около 4 х 10 клеток/мл). Дрожжевые клет,ки удаляют центрифугированием (в течение 5 мин при 5000 об,/мин). Клетки повторно суспендируют в 10 млЗЕР и инкубируют в течение 10 мин при 30 С, Клетки еще раз центрифугируют (в течение 6 мин при 2500 об. /мин) и повторно суспендируют в 1 О мл ОСЕ.Затем добавляют 100 мкл глузулазы (р-глукоронидазы, арилсульфатазы) и инкубируют в течение 30 мин при 30 С. При этом получают сферобласты,10которые отделяют центрифугированием(5 мин при 2000 об,/мин) с последующей промывкой САБ и повторным суспендированием в 500 мкл САБ.120 мкл сферобластов смешивают15с 6 мкг плазмидной ДНК (рУ-ЮПВ-НцЗРИИ 1) и инкубируют в течение 15 минпри комнатной темперагуре, После добавления 1 мл раствора ПЭГ инкубируютв течение 15 мин при комнатной температуре, а затем клетки отделяют цент 20рифугированием (5 мин при 2000 об, /мин)Клетки повторно суспендируют в 150 мклБОС-раствора и инкубируют в течение30 мин при 30 С. Затей добавляют5 мл Топ-агара + 250 мкл 50 х минусЬец-раствора и наносят клетки на сор-битные пластинки, По истечении 24 дней инкубации при 30 С развиваются колонии,Б. Получение интерферона.25 мл УИВ + САА среды + 1 мл50 Х-ной глюкозы + 1 мл 50 х минусЬец-раствора инокулируют трансформированной дрожжевой колонией. Продолжительность инкубации составляет поменьшей мере 40 ч при 30 С. 13 млэтой культуры центрифугируют в тече.ние 5 мин при 4500 об,/мин, Центрифугат суспендируют в 0,5 мл 2 М гуанидин хлорида и после добавления 2 млстеклянных шариков (диаметр 0,40,5 мм) интенсивно встряхивают в теочение 10 мин при 4 С. Затем надосадоч"ную жидкость переливают в другуюо4емкость и инкубируют при 0 С, Стеклянные шарики промывают 0,5 мл 7 Мгуанидин хлорида и объединяют полученный раствер с надосадочной жидкостью,Раствор центрифугируют в течение1 мин при 12000 об. /мин, Надосадочная жидкость содержит 1 х 10 ф ед,ЛРК 41/л дрожжевой культуры.П р и м е р 3, А, Повторяют пример 1 с той лишь разницей, что вместо плазмиды рКНЮ 12 используют плазмиду рКНИ 11, вместо плазмиды р 9 А 2 используют плаэмиду Е 76 Е 9, При этом получают экспрессионный вектор рУ-ЮВНцдРИИ 2.15.5125 Фо рмула из об ре те н ияСпособ получения 11-интерферона человека, включающий трансформацию штамма ЯассЬагошусез сегечва 1 СИЗ-С 2 рекомбинантной плазмидой ДНК- рУ-ЗРВ-НиЛР 1 Я, инкубацию трансформированных клеток, разрушение клеточных стенок центрифугированием при 5000 я в течение 5 мин, суспендирование в 2 М гуанидин хлориде, добавление стеклянных шариков с последующим . встряхиванием; инкубацию надосадочной жидкости и объединение с раствором промывки стеклянных шариков, содержащим 7 М гуанидин хлорида, с послерующим центрифугированием при 12000 я в течение 1 мин. Составитель Н.КузенковаРедактор А,Маковская Техред М,Ходанич Корректор С.Шевкун Заказ 280 Тираж 496 ПодписноеВН 1 ИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва Ж 35 Раушская наб д 4/5 Производственно-издательский комбичат "Патент", г.ужгород, ул, Гагарина,103 Б, Повторяют пример 2 с той лишьразницей, что трансформацию дрожжейОсуществляют с использованием экспрессионного вектора рУ-,ЮВ-Нп,1 РИЯ 2.При этом получают 1 х 10 ед. интерфе;,она И 2.ЗРМЫ 2 отличается от ЗРИИ 1 лишь за. меной кодирующего П 1-ю аминокислотукодона ССС на кодон САС (кодирующийГлутаминовую кислоту).П р и и е р 4, Опыты по определейию антивирусной активности,А, Ачтивирусная активность на человеческие клетки.Линия клеток: человеческая линияклеток рака легкого А 549(АТСС СС 1185),Вирус: мышиный вирус энцефаломиокардита.Тест-система: подавление цитопатического эффекта (всетитрования осуществлялись четырехкратно),25Интерферон по примерам 2 и 3 тит"руют в пригодном разбавлении в указанной тест-системеПрепарат покаЭывает ярко выраженную антивируснуюактивность при удельной активности8300 международных частиц/мг в расчеТе на стандарт (Со-901-527). ИзВестные человеческие интерфероны тиПа Ы, р и показывают такую же антиВирусную активность только при удельНой активности 8700, 9000 и 8800 меж,Цународных единиц/мг соответственно,Б.Антипролиферативная активностьЙа человеческие клетки,Человеческую линию клеток Папахвыращивают в присутствии человеческо 40го интерферона по примерам 2 и 3 и 8известных человеческих интерфероновтипа о(,и у, которые использовалисьв различных концентрациях, Через шестьдней инкубации при 37 С определяютплотность клеток. Необработанные культуры служат в качестве контроля, Всекультуры приготавливают трехкратнои испытывают параллельно, При этомобнаружено, что ярко выраженное подавление пролиферации клеток обеспечивает интерферон примеров 2,3 в количестве 100 международных единиц,а интерфероны типов , р и у- в количестве 110,125 и 130 международныхединиц соответственно.Сравнение результатов опытов Аи Б свидетельствует о том, что новыйУ-интерферон проявляет ту же антивирусную активность, что и известныеинтерфероны типов о, р и у, но применьшей концентрации, т.Е, он обладает лучшей антивирусной активностью,