Способ экстракции лизосомальных ферментов

(71) Новосибирстут л. Рй мед 1 СКИИ ИНС В.А утелья1976.Ъапдеч 1 пп пег 1пя ое абаз му69, 5, и епепгу гг., 1 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЭОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССРОПИОА НИЕ ИЗОБРЕ ОРСНОМУ СВИДЕТЕЛЬСТ(57) Изобретение относится к области биохимии, а именно к способам очистки ферментов. Целью изобретения является упрощение процесса и увеличение выхода целевого продукта. Способ предусматривает дифференциальную экстракию лизосомальных ферментов из грубочпценного препарата митохондриальнокомольной субклеточной фракции в рисутствии дигитонина в концентрациях 0,3-0,4 мМ. 2 ил., 2 табл,Таблица 1 ОтносительСодержание активности,от содержания в го" Ферменты ная удельная активность могенате печени 31,21,1 Белок Кислаяфосфатаза 63,5+4,4 2,06+0,18 Кислая РНКаза 61,6+4,8 1,93+0,16 3-галак- тозидаза 70, б+3,1 2,24+0,08 Цисте" иновые катепси 84,5+3,4 ны 2,72+0) 13,Катепсин 0 2,73+0,27 80,7+4,3 Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам очистки ферментов.Цель изобретения - ускорение и5 уйрощение способа и увеличение выхода целевого продукта.На фиг.1 и 2 представлены графий, поясняющие предлагаемый способ.Способ заключается в выделении бфльшей части клеточных лизосом в с ставе митохондриально-лизосомальной ф акции гомогената печени, получаем й достаточно просто и быстро метод м дифференциального центрифугирова н , с последующимиспользованием о обенностей химического состава лиэ сомальной мембраны, которая в сравн нии с мембранами других .органелл, в частности митохондрий, обогащена х лестерином, Способностью к специфич скому связыванию с холестерином ( очнее с 3,-,оксистероидами) с пос едующейлабилизацией мембраны обла,д ет стероидный гликозид дигитонин. П и этом чувствительность лизосом к д гитонину максимальна среди всех основных цитоплазматических структур и наиболее существенно отличается от таковой митохондрий.П р и м е р, 1, Печень животных,. уйерщвленных декапитацией, перфузи-, рют холодным раствором 0,25 М сахаррзы, 1 мМ ЭДТА, рН 7,4 (стандартный раствор сахарозы - СРС). Гомогенат печени (ткань: среда 1:3) подвергают центрифугированию (700 д, 13 мин). Осажденную ядерную фракцию промывают дважды ресуспендированием в 15 мл олодного СРС с последующим переосаждением частиц при 700 я, 11 мин. Объединенный супернатант центрифугиуют на препаративной центрифуге К("Янецки", ГДР) со скоростной насадкой при 13600 об/мин (13000 о) 1 мин Осадок митохондриально-лиэогсомальной фракции промывают ресуспендированием в 5 мл СРС и повторным Осаждением при 3600 об/мин, 11 мин. Конечный осадок суспендируют в 15 мл СРС (концентрация белка 32-42 мг/мл). 50о Все операции проводят при 0-4 С. Выход активности лизосомальных ферментов в объединенной митохондриальной (митохондриально-лизосомаль ной) фракции 62,0-84,5 при содержании белка 31,2 . от содержания в гомогенате печени,Содержание активности лизосомальных ферментов в митохондриально-лизосомальной фракции (МЗл) приведено в табл.1. Относительная удельная активность лизосомальных ферментов находится в пределах от 1,93 для кислой фосфатазы до 2,73 для катепсина Э.П р и м е р 2. Дигитонин растворяют в диметилсульфоксиде и разводят СРС до концентрации 4 мМ. Суспензию органелл митохондриально-лизосомальной фракции смешивают в соотношении 1; 1 с раствором дигитонина О, 8 мМ и выдерживают во льду в течение 30 мин. Затем смесь центрифугируют (18000 8, 15 мин). Надосадок, представляющий прозрачную желтоватую жидкость, используют в дальнейшем как экстракт лизосом. Установлено, что раствори- тель диметилсульфоксид не вызывает повреждения лизосомальиой мембраны.Действие различных. концентраций дигитонина в изотоничных растворах сахарозы на солюбилизацию лиэосомальных ферментов представлено на фиг.1. До концентрации дигитонина 0,1 мМ (включительно) заметного освобождения ферментов лизосом не происходит (фиг.1, график 1 - белок, 2 - кислая фосфатаза, 3 - кислая РНКаэа, 4 -,-галактозидаза, 5 - катепсины В, Е)Н, 6 - катепсин Р). В интервале 0,20,4 мМ дигитонина наблюдается резкийприрост солюбилизируемой активностиферментов, заканчивающийся выходомна плато. Последующее увеличениеконцентрации дигитонина до 1,6 мМслабо отражается на приросте активности Аерментов, хотя в интервале1,6-2,0 мМ отмечено разнонаправленное действие дигитонина на активностькислой АосАатазы и цистеиновых катепсинов (катепсинов В,. Ь) Н).Степень солюбилизации отдельныхферментов различна. При 0,4 мИ дигитонина полному освобождению из лиэосом подвергаются активность -галактоэидазы и активность цистеиновыхкатепсинов. В этих же условиях кислаяфосфатаза, кислая РНКаза и катепсинР солюбилиэируются на 53-60%.Выход активности лизосомальныхферментов (от их содержания в гомогенате печени) при концентрации дигитонина 0,4 мМ от 32% для кислойРНКаэы и 38% для кислой фосфатазы до72% для (3 -галактозидазы и 81% дляцистеиновых катепсинов. При дальнейшем увеличении концентрации дигитони- )Она заметный прирост выхода активности наблюдается только для кислой Фосфатазы,Освобождение белка органелл развивается медленно до концентрации тов. Влияние дигитонина на активностьлизосомальных ферментов митохондриально-лизосомальной фракции, обработанной 0,1%-ным тритоном Х(М 3:ш показано в табл.2.35Таб лица 2 Активность ферментов, %. от контроля Концентрация дйгитонина) мМ(3-галактозидаза Кислая РНКаза Кислая Аосфатаза,8 102, 1+1 05,5+1,5 50ю щ и й с я тем, что, с целью упрощения процесса и увеличения выходацелевого продукта, в качестве исходного сырья используют грубоочищенный 55 препарат митохондриально-лизосомальчой субклеточной Аракции, гомогенатапечени, а в качестве экстрагирующегоагента применяют дигитонин с концентрацией 0,3-0,4 мМ. Формула изобретенияСпособ экстракции лизосомальных ферментов, включающий выделение фрак ции лизосом из исходного сырья методом дифференциального центрифугирования с последующим разрушением мембран лизосом и получением фракции матрикса органелл с использованием экстрагирующего агента, о т л и ч ао4дигитонина 0,8 мМ (Аиг.1, график 1),и далее заметно возрастает,В соответствии с данными по солюбилизации Ферментов относительнаяудельная активность (ОУА) Аерментовлизосом резко возрастает при 0,2 мИдигитонина и достигает максимальныхзначений при 0,4 мИ (фиг.2, график1 - кислая АосАагаза, 2 - кислаяРНКаза, 3 - -галактозидаза) 4 - катепсины В, 1.) Н, 5 - катепсин Э).Наибольшие значения ОУА получены дляцистеиновых катепсинов (30,7) и /3 -галактозидазы (24,9), а наименьшие -для частично мембраносвязанных ферментов - кислой РНКазы (12, 1) и кислойфосфатазы ( 14, 1) . При концентрациидигитонина 0)Я мМ и выше наблюдаетсярезкое снижение ОУА лизосомальныхферментов экстракта органелл в реазультате заметного прироста солюбилизации белка, что особенно отчетливоотражается на ОУА /3-галактозидазыи катепсинов. дигитонин не оказывает действияна активность лизосойальных Фермен,М Н. ХодаравдюковаСоставител Техред Л.С Корректор Э.Лончакова Редактор И ая Заказ 6934/28 Тираж 520ВНИИПИ Государственного комитета по изобрете113035, Москва, Ж, Раущск едприятие, г, Ужгород, улПроектная О 1 О ЗО О ф ЯиааааКиНИРрйигиааиПодписноеиям и открытиям при ГКНТ СССя наб., д. 4/5