Способ приготовления препаратов молочных белково-жировых продуктов для изучения их микроструктуры

(6),УДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИИ К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬ(56) Кпоор Е. Бтц 1 гцгацйсдцгсЬ е 1 е 1 ггопепшЖговЕор 1вцсЬцп 8 еп ап Ейе 1 Ь цпо ММ 11 сГщ 1 ввепвйайг, 972,278,364-373.(54) СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ПРЕПАРАТОВМОЛОЧНЫХ БЕЛКОВО-ЖИРОВЫХ ПРОДУКТОВДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ ИХ МИКРОСТРУКТУРЫ(57) Изобретение относится к пищевой проиппленности, а именно к электронно-микроскопическим исследованиям,и может найти использование при приготовлении препаратов молочных белково-жировых продуктов для изученияих микроструктуры, Целью изобретенияявляется повьппение качества препаратов, Для приготовления препаратов мо"лочных белково-жировых продуктов дляизучения от микроструктуры методомэлектронной микроскопии высокожирныесмеси мороженого и стерилизованные молочные белково-жировые кремы фиксируют в водном 27.-ном растворе четырехокиси осмия, приготовленном на дистиллированной воде с рН 6,0 - 6,4 в течение 20-30 мин, центрифугиру" ют в течение 5-10 мин прн 2000 2500 об/мин, промывают в этиловом спирте с концентрацией 69-727, обеэвоживают сначала в этиловом спирте с концентрацией 79-827., а затем с концентрацией 95-977 и трижды с концентрацией 99,9-1003 с последующим центрифугированием после каждой промывки в течение 5-7 мин при 2000- 2500 об/мин, Затем проводят пропитку препарата смесью этилового спирта с19 с концентрацией 99,9-1003 и эпоксидной смолы в три этапа: на первом этапе в соотношении 1:1, на втором и третьем - в соотношении 1:1 - 1:3, центрифугируют после каждой пропитки 10-15 мин при 4000-5000 об/мин, осуществляют заливку в эпоксидной смоле в течение 15-18 мин с последующим центрифугированием в течение 20- 30 мин при 6000-8000 об/мин, полимериэацией, изготовлением срезов, размещением их на сетке, контрастирова- ф нием и просмотром в электронном мик- О роскопе, С)1 1370560Изобретение относится к пищевой ч промьппленности, а именно к электрон- к но-микроскопическим исследованиям и н может найти свое использонание приприготовлении препаратов молочныхбелково-жировых продуктов для изучения их микроструктуры.Целью изобретения является повышение качества препаратов,В предлагаемом способе фиксациюпрепарата проводят раствором четырехокиси осмия, приготовленным надистиллированной воде, с рН 6,06,4, Выбор четырехокиси осмия в качестве фиксирующей жидкости для молочных белково-жировых продуктов определяется тем, что использованиеводного раствора четырехокиси осмияс рН, близким к рН исследуемых продуктов, гарантирует сохранение субмицеллярного и мицеллярного состояния молочного белка. Четырехокисьосмия действует не только как фиксатор, но и как контрастирующее вещество. Кроме того, фиксация четырехокисью осмия препятствует экстракции липидон н процессе последующей заливки,Фиксация препаратов н течениеменее 20 мин не дает статистическидостоверных данных по толщине оболочки жирового шарика, что видимо,связано с малой и неравномерной проникающей способностью четырехокисиосмия, фиксация н течение более 30мин также не дает возможности получить качественные препараты, чтовызвано растворением липидно-бе, оных компонентов и прежде всег. оболочки жирового шарика при длительномконтакте материала с четырехс;исьюосмия.При фиксации препаратов исследуемых молочных белково-жировых продуктов н течение 20-30 мин полученыстатистически достоверные результатыпо толщине оболочек жироных шариков.Для уменьшения экстракции липидовможно использовать и качестве обезвоживающей жидкости этиловый спирт,Поэтому в предлагаемом изобретениипредлагается промывку, обезвоживаниеи пропитку проводить с использованием этилоного спирта.Погружение исследуемого материала после фиксации в спирт слабой концентрации (менее 697.) сопровождаетсяявлениями неравномерной мацерации,то приводит к сморщиванию белковыхомпонентов и особенно субмицеллярого слоя оболочки жирового шарика,н результате полученный разброс данных по толщине оболочки не поддается статистической обработке, Погружение же объектов сразу в крепкийспирт (абсолютный с концентрацией99,9-100/) приводит к разрыву оболочек жировых шариков и смещению структурных элементов, что, в конечномитоге, не дает нозможности получить статистически достоверные данные по размерам структурных элементов и правильное представление омикроструктуре, в частности, стерилизованных кремов с кофе и какао.Установя"ио что промывка объектов молочных белково-жировых продуктов в этиловом спирте с концентрацией 69-727 обезвоживание в спиртахвозрастающей концентрации (сначала79 - 82, затем 95 - 977 и трижды -в абсолютном спирте с концентрацией99,9 - 1007) обеспечивают необходимое качество препаратов. Наличиеследов воды мешает полимеризации блоков при последующей пропитке и заливке препаратов эпоксидной смолой,При одно- и двухразовой обработкепрепаратов абсолютным спиртом с кон"центрацией 99,9 - 1007. иногда в полимеризованных блоках, готовых кизготовлению срезов, обнаруживаютсяпузырьки воздуха, что связано с загрязнением препарата водой, При трехразовой обработке абсолютным спиртомпрепаратов качестно последних былогарантированным и артефактов припросмотре н электронном микроскопене наблюдали,Обезноженные препараты подвергаютпропитке в заливке эпоксидной смолой,Препараты исследуемых молочных белково-жировых продуктов обрабатывают сприменением центрифугиронания объекта на всех этапах подготовки его.Цель пропитки - проникновение эпоксидной смолы н исследуемый материал,Для получения прочных блоков био"логических объектов необходимо постепенно замещать обезвоживаюшую жидкость на эпоксидную смолу, поэтомупроцесс пропитки препарата осуществляют с постепенным замещением спирта эпоксидной смолой, Наличие менеевязкого спирта способствует болееглубокому и полному проникновению 10 1 г 20 25 30 35 40 45 50 5560 3 13705эпоксидной смолы в препарат, Применение центрифугирования после каждогоэтапа пропитки также облегчает проникновение эпоксидной смолы в препарат,5Экспериментально установлено,что трехэтапная пропитка препаратовсмесью абсолютного спирта (с концентрацией 99,9 - 1007) и эпоксидной смолы (на первом этапе в соотношении3:1, на втором и третьем " 1:1 и1:3) дает возможность сохранить всеэлементы ультрамикроструктуры продуктов и определить их размеры, Придругих соотношениях спирта и эпоксидной смолы наблюдаются разрывы оболочек жировых шариков, что ухудшает качество готовых препаратов.Экспериментально установлено также, что для исследуемых молочных бел ково-жировых продуктов заливка в эпоксидной смоле в течение 15-18 ч обеспечивает хорошую прочность полимеризованных блоков, При выдержке менее 15 ч встречаются мягкие блоки, 25 а при полимеризации более 18 ч - очень хрупкие, в обоих случаях получают некачественные срезы.Для получения качественных препапаратов образцы исследуемых молочных 30 белково-жировых продуктов обрабатывают с применением центрифугирования объекта на всех этапах подготовки его. Скорость и продолжительность центрифугирования при Фиксации, обез воживания пропитке и заливке экспе 9йриментально подобраны в зависимости от химического состава исследуемых продуктов, т.е, от вязкостных характеристик, 40П р и м е р 1, 2 г молочных белково-жировых смесей с содержанием жира 10 - 15 и 3,57 молочного белка, используемых при производстве мороженого, фиксируют 2 мл 2%-ного раство ра четырехокиси осмия в дистиллированной воде с рН 6,0 - 6,4 в течение 20 мин, центрифугируют в центрифуге ЦУМпри 2500 об/мин в течение 10 мин, для прекращения окисляющего действия фиксатора полученный осадок промывают 2 мл 70 -ного этилового спирта в течение 15 мин и центрифугируют 7 мин при 2500 об/мин, затем осуществляют обезвоживание осадка в спиртах возрастающей крепости (по 2 мл) в течение 5 мин вкаждом 70; 80; 96 и 3 раза в 100 -ном с последующим центрифугированием после каждой обработки в течение 7 мин при 2500 об/мин. Предварительную пропитку проводят в смеси 100 ного спирта и эпоксидной смолы аралдит в пропорции 3:1, 1:1, 1:3 в течение часа при комнатной температуре с центрифугированием после каж" дой обработки в течение 15 мин при 5000 об/мин, В чистой смоле осадок оставляют на 15 ч, затем центрифугируют в течение 30 мин при 8000 об/мин н переносят осадок в желатиновые капсулы, наполненные заливочной смолой (аралдит М + аралдит НУ в равных количествах с добавлением 1,57, катализатора) и полимеризуютопрн 45 С в течение суток и при 60 С 2 суток, Из полученных блоков с белково-жировой смесью изготавливают ультратонкие срезы, монтируют их на сетки, контрастируют 2 -ным раствором уксусно-кислого уранила в 70 -ном спирте в течение 10 мин и цитратом свинца - 15 мин, Срезы просматривают в электронном микроскопе,П р и м е р 2. Стерилизованные крем с кофе и крем с какао, сЬдержание 457 молочного жира и 57 молочного белка, являются маслоподобными продуктами и имеют достаточно прочную структуру при температуре храненияо0 - 10 С. Поэтому для фиксации вырезают кусочки кремов размером не более 1 1 мм, заливают 27"ным раствором четырехокиси осмия в дистиллированной воде с рН 6,0 - 6,4 и фиксируют 30 мнн при комнатной температуре. Фиксирующую жидкость декантируют без центрифугирования. Остальные операции проводят аналогично примеру 1: при промывке и обезвоживании пробы центрифугируют после каждой обработки 5 мин при 2000 об/мин, при предварительной пропитке пробы центрифугируют 15 мин при 4000 об/мин, пропитку в чистой смоле осуществляют в течение 18 ч с последующим центрифугированием при 6000 об/мин в течение 20 мин,Предлагаемый способ позволяет получить качественные препараты молочных белково-жировых продуктов, изучить их ультрамикроструктуру, установить размер структурных элементов, в том числе жировых шариков, толщину их оболочки, мицелл казеина, толщину дисперсионных прослоек и13705 10 20 Составитель Н,АбрамоваТехред М.Ходанич Корректор С,Черни Редактор А,Маховская Заказ 414/44 Тираж 847 В 1 ПП 1 ПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб д,4/5Подписное Производственно-полиграфическое предприятие, г,ужгород, ул,Проектная,4 провести статистическую обработку полученных данных.Применение водных растворов четырехокиси осмия, фиксация при комнатной температуре, исключение ацетона при промывке, обеввоживания, предва" рительной пропитке и центрифугирование после каждого этапа обработки материала дает возможность повысить качество исследуемых препаратов на 80-853. Использование предлагаемого способа позволяет также разработать научно обоснованную технологию стерилизованных кремов с кофе и какао со сроком хранения до трех лет и дает воэможность усовершенствовать технологию приготовления мороженого. Формула изобретения Способ приготовления препаратов молочных белково-жировых продуктов для изучения их микроструктуры методом электронной микроскопии, о т л ич а ю ш и й с я тем, что, с целью повьппения качества препаратов, в качестве исходного сырья используют 30 высокожирные смеси мороженого и стеб 06рилиэо ванные молочные белково-жировые кремы, которые фиксируют в водном 27.-ном растворе четырехокиси осмия, приготовленном на дистиллированной воде, с рП 6,0 - 6,4 в течение 20 - 30 мин, центрифугируют в течение 5 - 10 мин при 2000-2500 об/мин, промывают в этиловом спирте с концентрацией б 9-727 обезвоживают сначала в этиловом спирте с концентрацией 79-827., а затем с концентрацией 95-972 и трижды - с концентрацией 99,9-1007, с последующим центрифугированием после каждой промывки в течение 5-7 мин при 2000-2500 об/мин и проводят пропптку препарата смесью этилового спирта с концентрацией 99,9-100 Х и эпоксидной смолы в три этапа: на первом этапе в соотноше- нии 3:1, на втором н третьем в соотношении 1:1 н 1;3, центрифугируют после каждой пропитки 10-15 мин при 4000-5000 об/мин, осуществляют заливку в эпоксидной смоле в течение 5-18 мин с последующими центрифугированием в течение 20-30 мин при 6000-8000 об/мин, полимеризацией, изготовлением срезов, размещением их на сетке, контрастнрованисм и просмотром в электронном микроскопе,