Способ определения супероксидных анион-радикалов

/48 1/2 Я деятельСР ст о ОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ ИСАНИЕ ИЗОБР АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕ(71) Институт высшей нервнойности и нейрофизиологии АН СС(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СУПЕРОКСИДНЫХ АНИОН-РАДИКАЛОВ(57) Изобретение относится к облбиохимии, Для упрощения способа д бавляют в систему генерации радикалов краситель и эквимолярную смесь карнозина и ионов двухвалентной меди в конечной концентрации 1-10 мМ с последующей инкубацией, спектрофотометрией и определением результата по величине снижения скорости вос становления красителя, Для повышения специфической активности реагента, связывающего супероксидрадикалы, в смесь дополнительно вводят ионы двухвалентного цинка в зквимолярном соотношений, 1 з.п. ф-лы, 4 табл.25 Изобретение относится к биологи-ческой химии и может быть использовано в биохимии и медицине для определения генерации супероксидных ра 5дикалов химическими и биологическимисистемами.Цель предложения - упрощение способа достигается за счет использования в качестве специфического перехватчика супероксидных анионовэквимолярной смеси карнозина (р-аланил-гистидина) и ионов двухвалентной меди в конечной концентрации1-10 мМ. С целью повышения специфической активности перехватчика всмесь дополнительно вводят ионы двухвалентного цинка в эквимолярномссоотношении.П р и м е р 1. Определение специфической супероксидперехватывающейактивности карнозина в присутствииионов двухвалентной меди и двухвалентного цинка.Определение проводили в двухсистемах, генерирующих супероксидныерадикалы,Система 1. В кювет спектофотометравносили 1,7 мл 100 мМ фосфатного буфера, рН 8,3, 0,2 мл НАДН (0,7 мг/мл),ЗО0,3 мл феназинметасульфата (2,3 мг/мл).и 1 мл нитросинего тетразолиевого(4,8 мг/мл). Записывали изменениеоптической плотности при 560 нм наспектрофотометре в течение 1,5 мин,Возрастание оптической плотности,характеризующее скорость восстановления красителя, происходило линейно.На основании этой скорости определяют скорость .генерации супероксидныханион-радикалов. В качестве красителяможно также использовать феррицитохром с регистрацией оптической плотности при 550 нм.Система 11. В кювету спектрофотометра вносили 0,2 мл ксантина(2 мг/мл), 2,7 мл натрий- карбонатногобуфера, 75 мИ, рН 10,2, содержащего1,5 х 10 фМ ЭДТА, 0,2 мл раствора ксантиноксидазы и 0,2 мл нитросинего50тетразолия (18 мг/мл), Возрастаниеоптической плотности при 560 нм происходило линейно в, течение 1,5-2 мин.В качестве красителя можно использовать ферроцитохром с регистрациейоптической плотности при 550 нм,Для подтверждения генерации этимисистемами именно супероксидных радикалов в кюветы добавляли суперок Таблица 1 Концентрация кар- Степень ингибированозина и СцЯО ния восстановления, (конечная), мМ нитросинего, Х 1,0 10 2,5 40 5,0 7,5 50 10,0 15,0 94 Из табл. 1 видно, что кариозны в присутствии СпЯО в зависимости от концентрации осуществляет перехват супероксидных радикалов, ингибируя восстановление красителя. Специфичность перехвата подтверждена отсутсипдисмутазу в различных разведени- ях, подбирая разведения таким образом, чтобы в пробе присутствовала 1 ед. активности фермента, т,е, то количество фермента, которое тормозит восстановления красителя в 2 раза. Рассчитать исходно это количество фермента исходя из концентрации белка невозможно в связи с различной удельной активностью разных препаратов супероксиддисмутазы и изменением удельной активности в процессе хранения.Готовили 100 мИ раствор карнозина, содержащий 100 мИ СиЯО, а также 100 мМ раствор карнозина, содержащий 100 мМ СпЯО и 100 мМ ЕпЯ 04. Проводили определение скорости генерации супероксидных анион-радикалов с использованием систем 1 и 11. Концентрация ингредиентов системы подобраны таким образом, чтобы скорость восстановления в отсутствие перехватчика составляла 0,1 ед. оптической плотности 10 с в обеих системахВ табл. 1 представлена зависимость степени ингибирования восстановлениянитросинего тетразолия (эта зависимость не различалась в системах 1 и 11) от концентрации карнозина и СцЯО 4.3 135232 ствием взаимодействия с другими радикалами кислорода (перекисью водорода в системе окисления скополетина, гидроксильными радикалами). Использование концентраций перехватчика ниже 1 мИ нецелесообразно, поскольку степень ингибирования незначительна. В связи с тем, что ошибка измерения сильно возрастает при превышении 10 степени ингибирования 70 Х, нецелесообразно также использовать концентрации выше 10 мМ.В табл. 2 представлена зависимость степени ингибирования от концентрации 15 карнозина в присутствии СцБО и ЕпБО,. Таблица 2 Степень ингибирования восстановлениянитросинего, Х.Концентрациякарноэина,СОБОФ иЕпЯ 04 (конечная), мИ 25 0,25 42 0,5 30 50 1,0 68 2,5 5,0 72 35 90 10,0 100 15,0 40 ФИз табл. 2 видно, что дополнительное введение в смесь ЕпБО приводит к существенному повьппению специфической активности перехватчика,.что дает возможность использовать его в значительно более низких концентрациях (ингибирование на 507 в отсут ствие ЕпБО 4 достигается при концентрации карнозина и СцБ 04 7,5 мМ, а в присутствии ЕпЯОпри концентрации 1,0 мИ). Перехватывающая активность карнозина в присутствии Еп без Со+ значительно ниже активности карнозина 5 в присутствии Сц". Следует также отметить, что введение в системы Си+ или Еп без карноэина в концентрации до 15 мИ вызывало снижение скорости 7а.восстановления красителя. Супероксидперехватывающей активностью обладаюткомплексы карноэина с медью или медью-цинком (известно, что с этимиметаллами карноэин образует прочныекомплексы).1Степень ингибирования, представленная в табл. 1 и 2 не зависит от использованного препарата карноэина исоли меди или цинка (сходные данныеполучены при использовании солянокислых солей меди и цинка; важно, чтобысоль была хорошо растворима, а анионбыл нейтральным - не взаимодействовал с системой генерации супероксида) .Таким образом, использование вкачестве перехватчика супероксидныхрадикалов карнозина в присутствииионов двухвалентной меди или цинкавместо супероксиддисмутаэы позволяетупростить способ определения супероксидных радикалов за счет отсутствиянеобходимости подбораконцентрацииперехватчика в каждой серии экспериментов, а также использования стабильных растворов перехватчика с неизменной специфической активностью.П р и м е р 2. Определение суперсоксидных анион-радикалов в биологических объектах,А. Определение генерации супероксидных радикалов лейкоцитами,Из крови крыс дифференциальнымцентрифугированием получают фракцию лейкоцитов, суспендируют в средеХенкса и в разных разведениях вносятв кювету спектрофотометра, содержащуюсреду Хенкса и нитросиний тетраэолий,подбирая такое разведение клеток,чтобы скорость нарастания оптическойплотности при 560 нм была линейнапо крайней мере в течение 1,52 мин, а скорость прироста оптическойплотности составляла О, 1+0,03 ед.оптической плотности 10 с. В пробыс подобранной концентрацией клетоквносят различные концентрации карнозина в присутствии ионов меди илимеди+цинка и определяют ингибирование скорости генерации радикалов.Для сравнения вносят супероксиддисмутаэу, концентрацию которой предварительно подбирают в одной из модецьных систем генерации супероксидныхрадикалов (см. пример.1, системы1 и 11) . Полученные данные представлены в табл. 3.5 1352327 Таблица 3 Таблица 4 Степень ингибирования скоРости 5 восстановСтепень ингибирования скоПерехватчик Перехватчик рости восстановления вления проба 1 проба 2 10 0% 0% 07. 40% Сц-карнозин, 7,5 мМ 307. 25%15 Сц-карноэин, 10 мМ 65% 50% 75% 407 Сц, 2 п-карнозин, 1 мМ 30% 257,80% Сц, 2 п-карноэин, 10 мМ 70% 60% 40% 307. 27% 707. 60% СОД, 1 .ед,СОД, 10 ед. 70% 80% Из данных табл, 3 видно, что большая часть радикалов, восстанавливающих нитросиний тетразолий, являетсясупероксидными радикалами, так какна 80%-ное восстановление ингибируется супероксиддисмутазой (СОД),Видно также, что использование вкачестве перехватчика карнозинав присутствии меди или цинка не 35уступает прототипу по специфичности.Б, Определение супероксидных анион-радикалов в спинно-мозговой жидкости,Определение проводили в пробахспинно-мозговой жидкости кролика(1) и человека (2), взятых при помощи пункции. Подбирали разведениепроб таким образом, чтобыскоростьвосстановления нитросинего была оптимальна (см. пример А) и на оптимальной концентрации спинномозговой жидкости в кювете спектрофотометра регистрировали скорость изменения оптической плотности в присутствии перехватчиков (табл. 4).Из данных табл. 4 видно, что впробе 1 - 70%, а в пробе 2 - 60%скорости восстановления нитросинеготетразолия ингибируется специфическими перехватчиками, значит именноэта часть приходится на долю генерации супероксидных анион-радикалов. 1. Способ определения супероксидных анион-радикалов путем добавления в систему генерации радикалов красителя и реагента, обладающего свойст вом связывать супероксид-радикалы, с последующей инкубацией, спектрофотометрией и определением результата по величине снижения скорости восстановления красителя, о т л и - ч а ю щ и й с я тем, что, с целью упрощения способа, в качестве реагента используют эквимолярную смесь карнозина и ионов двухвалентной меди в конечной концентрации 1-10 мМ. 2, Способ по п. 1, о т л и ч а - ю щ и й с я тем, что, с целью повышения активности реагента, в.смесь дополнительно вводят ионы двухвалентного цинка при эквимолярном соотношении корнозина, ионов цинка и ионов меди. Сц-карнозин, 7,5 мМСц-карнозин, 10 мМСц, 2 п-карнозин, 1 мМСц, 2 п-карнозин, 10 мМСОД, 1 едСОД, 2 едСОД, 10 ед Примеры показывают, что заменасупероксиддисмутазы на карнозинв присутствии ионов меди и цинкане приводит к снижению специфичности,точности и чувствительности способа,обеспечивая при этом его упрощение. Формула изобретения