Способ получения н-бутиловых эфиров производных n ацетилмурамилпептидов

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 19) 4 С 07 К 9/00 А г ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ ПАТЕН го и .быть и изостроения,использованы винфекционных оторые могутедицине дляболеваний,Цеых пептидов,лирующими своогенности. 11 осацией прислоты фо еь -н соз обл е новых акти ающих иммунорег и при низкой пи АП ведут конде го мурамиловой 11 и пептида ени оиз рму 11 дн ы ул ОсН-снО ВЬ ИАИ ф СН-С(О)0 сн,сн,с(о- 1 ЯН - СН - С(0)ОЯ ОСУДАРСТВЕНКЫЙ КОМИТЕТ ССС по ДелАм изОБРетений и ОткРы(71) Ажанс Насьональ де Валоризасьонде ля Решерш (АНВАР), (РЕ)(72) Пьер Лефрансье, Моник Паран,Франсуаз Одибер, Луи Шедид, Жан Шоайи Эдгар Ледере (РВ)(57) Изобретение касается пептидов,в частности получения М-ацетилмурамилпептидов (АП) общей формулы 1СН 0 И Н,С-СН-СЩХ ЕНСИСН, ЕН, СОЮЦ-СООй, ,где Х - Ь-аланил; Ь - серил; Ь ,валил; В., - С,-С, -алкил нормальногде 2, - бензил; У - Н илиХ-С (О) (СН ) С (О); Х и К, указанывыше, с последующим отщеплением защитных групп с помощью каталитического гидрирования в приСутствииСН СООН, Испытания АП Показывают,что они проявляют иммунорегулирующее действие и противоинфекционнуюактивность при низкой пирогенностии токсичности. 1 табл.1346046 СН 2 ОВ РЬ 0 сн Н,ОВь 1 с или р сн,ов Н,ОН б или 3 50 Изобретение относится к способу получения ноных химических соединений, конкретно н-бутиловых эфиров производных М-ацетилмурамилпептидон общей формулы Н, ОН с( или 3ИО СНз- ЗИСОСН, СО-Х-ЖН-СН - С ООС ьН э - н 1 СНгСНгСОЮнг где К в . сукцинил, Е -аминокапроил;Х - Ь-А 1 а,обладающих иммуностимулирующей активностью, и может найти применениев экспериментальной биологии и медицине.Цель изобретения - разработкаспособа получения производных И-ацетилмурамилпептидов, обладающих высокой иммуностимулирующей активностьюв сочетании с низкой пирогенностью,Поставленная цель достигается тем,что согласно предлагаемому способузащищенное производное И-ацетилмурамилпептида общей формулы СН 3 - СН ЗНСОСНЗ СО-Х-ХН-СН-СООСНВ-Н1 н,н,с 0 н,где Х - имеет указанное значение;РЬ - фенил;Вк 1 - бензил, обрабатывают 607-ной уксусной кислотой для удаления бензилиденовой защитной группы а затем однергают взаимодействию с янтарым ангидридом или п-нитрофениловым эфиром И-бензилоксикарбонил-с-аминокапроновой кислоты и от полученного соединения общей формулы СНЗ Сн ЮНСОСН 3 СО - Х-ЖН - СН - СООС НВ - нСН,СНгСОщнг 1где К - сукцинил, 11-бензилоксикарбонил-Е-аминокапроил;Вк 1 и Х имеют указанные значения, отщепляют защитные группы путем каталитического гидрогенолиза. Изобретение иллюстрируется следуюшими примерами,П р и м е р 1. н-Бутиловый эфир6-0-сукцинил-И-ацетилмурамил-Ь-аланил-Р-глютамина (1 а).(11 а) .1 О 3,634 г (5,0 ммоль) н-бутиловогоэфира 0 -бензил,6-0-бензилиден-Ыацетилмурамил-Ь-аланил-Р-глютаминасуспендируют в 250 мл 607-ной уксусной кислоты. Суспензию нагревают на5 кипящей водяной бане до полного растворения. Раствор фильтруют для удаления нерастворившихся частиц, фильтрат упаривают досухаПолученный продукт очищают на колонке с силикаге 20 лем, используя в качестве элюентасмесь хлороформ - метанол (6:1),фракции, содержащие целевой продукт,объединяют, упаривают и лиофилизуют.Получают 1,95 г (617) 11 а; Я р25 : +07,9 (С 11 ДМФА).Найдено,Е: С 55,3; Н 7,0; И 7,6;1,2, н-Бутиловый эфир Ы, -бензил 6-0-сукцинил-И-ацетилмурамил-Ь-аланил-Р-глутамина (111 а),ЗО К раствору 6387 мг (1,0 ммоль)11 а в 5 млбезводного пиридина добавляют 150,1 мг (,5 ммоль) янтарного ангидрида, Реакционную смесь переомешинают 24 ч при 40 С, охлаждают доо,0 С, добавляют безводный эфир. Выпавший осадок отделяют, растворяют в метаноле с добавкой уксусной кислоты,Раствор упаривают досуха, полученный кристаллический сироп растворяют40 в смеси ДМФА - вода (1:1) и подверга-ют хроматографической очистке на колонке с АС 1-Х, используя в качестве элюента раствор уксусной кислотыв ДМФА с градиентом 0 - 1 н. (2 х45 х 250 мл), Продукт элюируют 0,5 н,раствором уксусной кислоты в ДМФА.Фракции, содержащие целевой продукт,объединяют, упаривают и дважды лиофилизуют из уксусной кислоты. Получают 659 мг (892) 111 а;Я =412 мг 111 а,растворенного в 25 млледяной уксусной кислоты, гидрируютв течение 40 ч в присутствии 200 мг10 -ного палладия на угле. Затем катализатор отфильтровывают, фильтратупаривают. Остаток очищают хроматографически на колонке с силикагелем,используя в качестве элюента смесьэтилацетат - пиридин - уксусная кислота - вода (6:2:0,6:1), Содержаниецелевого продукта во фракциях определяют с помощью тонкослойной кроматографии на пластинкак с силикагелемв системе хлороформ - метанол (2:1).Фракции, содержащие целевой продукт,объединяют, упаривают, лиофилизуют.Получают 269,6 мг (81 ) продукта,который растворяют в воде и хроматографируют на колонке с АС 50 ИХ 2 (13 хх 1,5 см). Фракции, содержащие целевой продукт, лиофилизуют,Получают 217 мг 1 а; Я= +33,1(С 1,0; уксусная кислота).Найдено, : С 28,8; Н 6,6; М 8,5.Рассчитано,: С 28,9; Н 6,9;М 8,5,П р и м е р 2. н-Бутиловый эфир6-0-Е-аминокапроил-М-ацетилмурамилЕ-аланил/-глютамина (16).2.1. п-Нитрофениловый эфир М-бензилоксикарбонил-Е-аминокапроновойкислоты (116).2,653 г (10 ммоль) М-бензилоксикарбонил-Е-аминокапроновой кислотыорастворяют при 0 С в 25.мл ацетонитрила, содержащего 1,675 г (12 ммоль)п-нитрофенола. К раствору добавляют2,125 г (10,25 ммоль) дициклогексилкарбодиимида. Реакционную смесь перемешивают ночь при температуре окружающей среды, затем добавляют несколько капель уксусной кислоты. Выпавшую в осадок дициклогексилмочевину отфильтровывают, промывают ацетонитрилом, фильтрат упаривают досуха.Остаток перекристаллизовывают из смеси этилацетат - гексан.Получают 3,831 г (99 ) продукта,т.пл. 62,3 С,Найдено,7: С 62,4; Н 6,0; М 7,5.Рассчитано,7.: С 62,2; Н 5,7;М 7,3.2,2, н-Бутиловый эфир Ос -бензил 6-0-М-бензйлоксикарбонил-аминокапроил-М-ацетил-Ь-аланил-глютамина(4,0 ммоль) М-оксибензотриазола и0,44 мл (4,0 ммоль) М-метилморфолина,Реакционную смесь выдерживают 24 чи упаривают досуха, Остаток растворяют в этилацетате. Раствор промывают10 последовательно 5 -ным растворомМаНСО и насыщенным раствором МаС 1,сушат над Ма БО и упаривают. Остаток очищают хроматографически на колонке с силикагелем 60 /Мерк/, ис 15 пользуя в качестве элюента смесь хло."роформ - метанол (1 О:1), /Получают 556,2 мг (64 ) 1116.2.3. н-Бутиловый эфир 6-0-Я-амино- капроил-М-ацетилмурамил-Ь-аланил-П 20 глютамина (16).556,2:мг (0,64 ммоль) 1116 растворяют в 30 мл ледяной уксусной кислоты и гидрируют в присутствии 280 мг5 -ного палладия на угле. Через 40 ч25 катализатор отфильтровывают, фильтрат лиофилизуют. Полученный продуктрастворяют в 20 мл воды, содержащей0,7 мл 0,1 н. соляной кислоты ивновь лиофилизуют.30 Получают 393,6 мг (54 ) 16,Я р== +32,8 (С 0,5; уксусная кислота) .Найдено,7: С 47,7; Н 7,2; М 9,3;Рассчитано,7.: С 47,4; Н 7,2;З 5 М 9,3.Иммуностимулирующая активностьописываемых соединений была изученав опытах п чача в сравнении с известным структурным аналогом - М 40 ацетилмурамил-/-аланил-изоглютамином (МДП) .Токсичность,Токсичность соединений 1 а и 16была изучена на кроликах при парен 45 теральном введении, Установлено, чтоэти соединения в дозах до 5 мг/кг необладают токсическим действием.Способность вызывать лихорадку. Изучено влияние описываемых соединений на изменение температуры у кроликов в течение Зч после их вве .- дения, Соединения 1 а и 16 в дозе до 5 мг/кг не вызывали значительных из менений температуры. Соединение 1 ав дозе 10 мг/кг вызывало повьппениеотемпературы на 0,53 С, а соединение 16 в дозе 5 мг/кг - на 0,1-0,3 С.Таким образом, описываемые соедине346046 Формула изобретения Способ получения н-бутиловых эфиров производных М-ацетилмурамилпептидав общей формулыси,ов О Н ОН б, или 3сОСн,О СН - СН ЮН СО - Х -уксусной ую бенобр ои щи путемкислота 1,64 3,57+1,нтрол группу с посл откай полученнаг гарным ангидридом ловым эфирам г 1-бен аминакапронавой ки ного соединения о зилиденавую щей абраб динения ян и- нитрафени карбонил-си от получе ое- чли 3,64 54+0,5,64 2+О лот щей формул 6 8 78, ОВх ЛИ СН -ова,СН 2 ОИ сукцинил, И - б ен э илминакапроил;1 имеют указанныезащитные группы гдебонил50 оксикарТаким абрачаемые соглас олуом, са о пред ысокой стью в динения, п агаемому с иммуностим еВ ачения ули с н бу, обладаютрующей актив кой пирогенн ка отщепляю талитиче тани генолиза кого ью. ВНИИПИ Заказ 4935/57 Тираж 3 писно роектная, 4 Ужгар ния практически не обладают пирогенной активностью,Иммунастимулирующая активность,В опытах на мышах была изученаспособность соединений 1 а, 1 б и ИДИвлиять на антителоабразование, В качестве антигена использовали бычийсывороточный альбумин (БСА) в дозе500 мкг на одно животное. Группам по8 мышей швейцарской породы в возрасте 2 мес вводили падкожно 500 мкгБСА с добавкой изучаемых соединенийв дозе 00 мкг в изотоническом физиологическом растворе. Контрольнойгруппе вводили только БСА, Через 21день определяли содержание антителметодом пассивной гемагглютинации сиспользованием эритроцитов баранов,обработанных формалином (первичныйотзыв), Затем животным повторно вводили 500 мкг БСА и через 16,цней определяли содержание антител (вторичный отзыв),Полученные результаты прецставле в таблице,Содержание антител указано огарифмических величинах па оию 2. роиэв.-полигр. пр-тие,цинил, :,-аминокапроил;аю щ и й с я тем, что из о эфира защищенного произцетилмурамилпептида общей ЪНСОСН О - Х - ЯН - СН - СООС 1 Н 9