Способ выделения и очистки урокиназы из биологических жидкостей

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 51) 4 Сс Яух;,О САНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ ИДЕТЕЛЬСТВУ ТОРСКО 28-13 Бюл.с следовнской т тельский инстхнологииМ,В, Зиновьев.Л. Пичугин иасенко иков и88.8)е свидС 12 ельство СССР9/72, 1975. качеств аммиака элюентаСкорость нцентр за элю аммиак тивность ка в пол Выход ур ная акти ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ(54) СПОСОБ ВЬДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ УРОКИНАЗЫ ИЗ БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЕЙ(57) Изобретение относится к способамполучения очищенных ферментов, аименно урокиназы, и может быть использовано в медицинской промьипленности для получения препаратов урокиназы. Целью изобретения является повьппение выхода и удельной активностицелевого продукта. Способ предусматривает использование в качестве сорбента при адсорбции фермента пористых кремнеземов или лигнина отмывкисорбента 0,05-0,2 М трис-НС 1 буфернымраствором рН 8-10 и элюцию фермента2-47-ным водным раствором аммиака.Культуральную жидкость, полученнуюпосле выращивания перевиваемой культуры клеток почек человека, объемом5 л и активностью 30 СТА и 1 мл пропускают через колонку 418 см, заполненную пористым стеклом МПС-ВГХв течение 2 ч. Затем колонку отмывают 500 мл 0,1 М трис-НС 1 буферногораствора рН 10, Урокиназу элюируют изколонки после отмывки, используя в 47.-ныи водныи растворэлюции 6 мл/мин. рованная и очищенная урокируется из колонки вместе с в объеме 90 мл и имеет ак СТА/мл. Содержание белченном препарате 0,4 мг/мл. киназы составляет 967,удельность 4000 СТА/мг.табл, 1 13250Изобретение относится к способамполучения очищенных ферментов, а именно урокинаэы, и может быть использовано в медицинской промьппленности дляполучения препаратов урокинаэы.Целью изобретения является повыгпение выхода и удельной активностицелевого продукта.Способ заключается в том, что адсорбцию урокиназы ведут на пористом 1 Окремнеземе или лигнине, а удалениебалластных белков иэ сорбента осуществляют путем его отмывки трис-НС 1буфером рН 8,0-10,0,Предлагаемый способ осуществляется следующим образом.Биологическую жидкость, содержащуюурокиназную активность, пропускают через колонку, заполненную пористымстеклом или лигнином. Объем колонки 20соответствует 0,1-0,0 объема пропускаемой жидкости. Затем колонку отмывают от примесей, пропуская трис-НС 1буферный раствор, рН 10. Обычно пропускают 2-5 объемов колонки такого 25буфера. После отмывки колонки адсорбированн;ю урокиназу элюируют 247-ньм водным раствором аммиака,пропуская его со скоростью около1 см/мин. 30Урокиназа элюируется узкой зоной,обычно в объеме, равном 0,5 объемаколонки, вследствие чего происходитее концентрирование в десятки раз.Выход очищенной и концентрированнойурокиназы составляет 80-957.П р и м е р 1, Выделение урокиназы из культуральной жидкости.Культуральную жидкость, полученную после выращивания перевиваемой 40культуры клеток почек человека,объемом 5 л и активностью 30 СТА/млпропускают через колонку 4 18 см,заполненную пористым стеклом МПС2000-ВГХ, в течение 12 ч. Затем колонку отмывают 500 мл 0,1 М трис-НС 1буферного раствора, рН 1 О. Урокинаэу элюируют из колонки после отмывки,используя в качестве элюечта 47-ныйводный раствор аммиака. Скорость элюции 6 мл/мин., Концентрированная иочищенная урокиназа элюируется из колонки вместе с аммиаком в объеме90 мл и имеет активность 1600 СТА/мл.Содержание белка в полученном препарате 0,4 мг/мл. Выход урокиназы 967,удельная активность 4000 СТА/мг.П р и м е р 2, Культуральную жидкость объемом 250 мл и активностью 76 21 СТА/мл пропускают через колонку112 см, заполненную силохромом С,в течение 2 ч. Затем копонку отмывают0,05 М трис-НС 1 буфером, рН 8 (30 мл).После отмывки через колонку пропускают 27.-ный раствор аммиака. На выходеаммиака иэ колонки собирают фракциюобъемом 4 мл, содержащую концентрированную и очищенную урокиназу, активность фракции 950 СТА/мл. Выходурокина;ы 907, удельная активностьпрепарата 3300 СТА/мг,П р и м е р 3. Выделение урокинаэы из мочи,Мочу человека, разбавленную пополам водой, объемом 2,5 л и активностью 9 СТА/мл пропускают через колонку ,510 см, заполненную пористымстеклом МПС - 2000-ВГХ. Отмывку колонки проводят 0,05 М трис-НС 1 буфером, рН 9. Элюцию урокиназы осуществляют раствором аммиака, Получают7 мл очищенной и концентрированнойурокинаэы. Выход урокинаэы 853,удельная активность 2600 СТА/мг,П р и м е р 4. Выделение урокиназына лигнине,Культуральную жидкость.;, полученную после выращивания перевиваемойкультуры почки человека, объемом500 мл и активностью 17 СТА/мл пропускают через колонку, заполненнуюлигнином (выделенным из хвойных пород деревьев). Объем колонки 112 см.Затем колонку отмывают 0,05 М трисНС 1 буфером, рН 1 О (30 мл). Послеотмывки через колонку пропускают47-ный водный раствор аммиака. Навыходе аммиака иэ колонки собираютфракцию объемом 4 мл, содержащуюконцентрированную и очищенную урокиназу. Активность фракции 250 СТА/мл,содержание белка 0,25 мг/мл. Выходурокинаэы 807, удельная активностьпрепарата 5000 СТА/мг,П р и м е р 5. Выделение урокиназы проводят согласно примеру 4. Для отмывки колонки используют 0,05М трис-НС 1 буфер, рН 8,0. Элюцию урокинаэы проводят 27-ным водным раствором аммиака. Выход урокиназы 857 удельная активность препарата 4500 СТА/мг,П р и и е р б. Культуральную жидкость объемом 1 л и активностью 20 СТА/мл пропускают через колонку 1,510 см, заполненную макропористым стеклом МПС в 2500 вХ, в течение 4 ч, Затем колонку промывают 0,2 М трис1325076 4Таким образом, при рН отмывдющего о- буфера вьш 1 е 10 наблюдается вымывание и- фермента, д при рН ниже 8 содержаниепримесного белка в препарате повы 5 шдется.Специфическим элюентом для урокиназы является аммиак. Водным 2-47-нымраствором аммиака удается полностьюэлюировать адсорбировднцую на колонк ке урокиназу, что не удается при ист- пользовании различных буферных растворов. Более высокий процент аммиакадля десорбции не желателен, так как т это не повышает выход фермента, а - 15 приводит лишь к повы 111 еццой растворимости матрицы сорбент 11. - Предлагаемый способ облдддет тсхСпособ выделения и очистки урокиназы из биологических жпцко 1 тей, 55 предусматривающий ддсорбцпю фер,1 ентдна сорбенте, отмывку сс 1 рбсцтд и э.1 пяцию урокиназы 2-4 .-ц 1 ьм р:1 створом д 1". -НС 1 буферным раствором, рН О, Урокинаэу элюируют 27-ным водным раствром аммиака. Концентрированная урокназа ( объем 9 мл ) имеет удельную активность 3080 СТА/мг. Выход урокинаэы 987П р и м е р 7. 16000 мл свежесобранкой мочи человека активностью13 СТА/мл пропускают через колонку2,220 см, заполненную пористым стелом МПС 1,150-ВГХ, в течение ночи, Омывку от балластных белков проводят0,1 М раствором трис-НС 1 буфера,рН 10. Элюцию урокиназы осуществляю27-ным водным раствором аммиака. Получают 170 мл бесцеветцого раствораконцентрированной очищенной у. к .Идэы, удельная активность 3900 ЛА;мг,выход 967.Предлагаемый способ позволяет получать в одну стадию с выходом 80-987.препарат урокиназы с удельной активностью до 4500 СТА/мг, Для получениявысокоочищенного препарата предусматривается проведение общепринятых хроматографических операций.Сорбенты, используемые в предлагаемом способе, обеспечивают достаточно полный выход фермента. Ранеедля получения урокиназы эти сорбенты 30не использовались.Предлагаемый способ обладает значительными преимуществами перед известными, прежде всего он прост в изготовлении, так как выделение и очистка фермента происходит в один этапс использованием одного сорбента,Очистка обеспечивается отмывкой колонки экспериментально подобраннымбуферным раствором, после чего очуществляется элюция Фермента.Установлено, что урокиназа достаточно прочно связывается с пористымикремнеземами и лигнином. Вследствиеэтого, отмывку производят буферными 45растворами с достаточно высоким рН,что обеспечивает удаление большинства примесных белков, Интервал рН буферных растворов, при которых удаляются примесные белки, но не происходит вымывание фермента, должен находиться в пределах 8-10, ОтключениерН в одну или другую сторону це обеспечивает необходимые чистоту и вь 1 ход препарата.Влияние рН отмывающего буферногораствора на очистку урокиназы показано в таблице,ЦО.1 ОгИЧЦОСТЬЮ, таК КДК .1 С ГКс 1 ОСУЩЕСТвим при стерильных условия.: ц промьш 1 ленцых масштабах. Культурд:1111 дяжидкость и буферные растворы стерильно подаются в колонку, которую 11 редвдрительно стерилизуют и 1 срметпэируют. Контроль зд прс пессом осупксствл 11 ют с помощью протс 1 чпогс 1 спектрофс 1 тометрд. Сорбецты испо 11 ьэуют многократно,они не содержат вредных примесей, пх сорбционные свойства восстанавливаются после пропуск:1 пи че - ре, колонку 4 -цогс рдс 1 ворд 1;щипкаКроме того, предлагаемым с пэсобом при ис;пользовании в кдч .Ств сорбептд лигцицд возмс 1 жцо полу 1 дт 1 преп раты, обладающие высокой уде.п.пой дкТИВПОСТЬЮЭТО С 11 ЯЗДцо С ТЕМ, ЧТО лпгциц более специфическ 1. свяэывдет ся с урокицдзой по срдвцеппю с пористым кремнеземом.Пред:1 дгдемьп 1 способ воспроизло- ДИМ В ацаЛИтИЧЕСКОМ И П 11 Е 11 ДРДтцвнпМ ндрпднтах, оц может пр 1пяться цля получения урокина 1,1 в 11 дс 1 с 1 рдторплх и мссди 1,инской промьш 1 лс цц э Г тп . Биоло - гические показатели полу 1 е 11 ц 1,1 х прспдрдтов (при испольэс нд 11 ип этого способа) свидетельствуют о 11 оэмсжцости их использования для мс,"11 ици 1 ьь 1. Фо рмула из обре те ция мидка, о т л и ч а ю щ и и с я тем,что, с целью повышения выхода иудельной активности целевого продукта, в качестве сорбента испольэуютпористый кремнезем или лигнин, а отПараметры 22 5 2 3 0,2 0,3 0,2 0,8 0,4 0,5 0,3 0,3 0,1 М трис-НС 1. Составитель И. Привалова Редактор Н. Гунько Техред Н,Глущенко Корректор Г.Решетник еЗаказ 3021/24 Тираж 499 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб д. 4/5Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 Содержание урокииаэы в отмывающем элюате (9 Х),Х Содержание белка в конечн. препарате, мг/млЪ. 325076 брывку сорбента с одновременныч удалением балластных белков осуществляют0,05-0,2 М трис-НС 1 буфером рН 8,010,0. Показатели при рН отмывающего буфера8,0 8,5 9,0 9,5 10,0 10,5