Способ получения орготеина

(31) 273278 (33) СШАОпубликовано 15.11,76. БюллетеньДата опубликования описания 13,12.7(51) М. Государствонныи ком ите Совет Министров ССС по делам изобретений 3) УДК 576.8.09(72) Авторыизобретен Иностранц льфганг Хьюбер, Марк Гари Се СШАи Силвер Хьюнг Ч аявитель Иностранная фирма Диагностик Дэйта Инк США(54) СПОСОБ ПОЛ УЧ ЕН тение относится к области медициенно к фармацевтической промышИзобрены, а имленности.Известен способ получения орготеина из экстрактов тканей хкивотных и птиц путем хроматографии на диэтиламиноэтилцеллюлозе. Однако известный способ не обеспечивает высокой степени чистоты целевого продукта.С целью повышения степени чистоты целевого продукта экстракт предварительно обрабатывают протеолитическим ферментом.Способ получения орготеина осуществляют следующим образом.Используют исходную смесь протеинов, содержащих оргогеин, которую подвергают ферментному воздействию выбранного протеолитического фермента, при любых условиях температуры, р 1-1, времени и соотношении протеинов к энзиму, которые подходящи для выбранного энзима.Исходную смесь протеинов испольуют в любом водном растворителе, в котором орготеин растворим и устойчив. Применяюг буфер, например с рН 1 - 13 (предпочтительно 4 - 1 О), содержащий небольшое количество одного или более двухвалентных металлов, например, Со, Сц, Ге, бе, Мд, Хп, Мп или Са, имеющие ионную силу менее чем 0,1 М. Смесь протеинов, включающих орготеин, используют в любой подходящей концентрации,например 0,01 - 10%, в выбранном водномрастворителе. Раствор имеет ионную силу0,001 в 0 которая обеспечена солью, например МаС 1 или буфером, например, трис, трисглицином, фосфатом и содержит один илиболее двухвалентных металлов, например Мп,Сп, п иили Мд.10 Энзиматическое разрушение обычно проводится при температуре около 20 - 40"С, но может быть более высокая и более низкая температура, например, 0 - б 0 С, причем, оптимальная температура зависит от активности15 и устойчивости выбранного энзима,Соотношение энзима к исходной смеси протеинов зависит от соотношения орготеина иинородных протеинов в исходной смеси. Количество эизима также зависит от активности20 выбранного энзима.Очищенный таким образом орготеин мокнетбыть выделен и далее очищен различнымипутями. Протеолетически разрушенные протсииы, являются ли они олигоиептидазами или25 аминокислотами, легко отделяются от очищенного орготеина, например, путем одного илиболее приемов ионообменной или гелевой хроматографии с помощью фракционного осажде55 60 65 ния растворителем, или сульфатом аммония и/или ультрафильтрацией нли мембранным диализом.Если белковые примеси остаются, они могут быть отделены после диализа, чтобы удалить протеолитически разрушенные белки путем адсорбции и последующим элюированием и слабо кислотной или слабо основной ионообменной колонки, или гелевой фильтрацией, хроматографией, фракционное осаждение растворителем, например, ацетоном или этанолом, или сульфатом аммония и нагревание, например, при 70 - 75 С, чтобы осадить оставшиеся белковые примеси.П р и м е р 1. 1 кг бычьей печени смешивают с 2 л 0,025 М тройного буфера, рН 7,5 в 0,3 М сахарозе и 0,05 М КС 1. Суопензию центрифугируют в течение 1 - 2 ч. Мутный верхний слой жидкости занимает объем 2150 мл и имеет рН 6,3 100 мл порция поверхностного слоя (60 мг протеина 7 мл, 0 - 15 мг - 0,3 мг орготеина/мл дигерируют при температуре окружающей среды в течение 20 ч в присутствии протеолитических ферментов: проназы, панкреатина, субтилизина, пептидазы, папаина, бромелапна (ананаза),Лнализ электрофоропраммы (после диализа для удаления разрушенных протеинов и фильтрации) превращенного энзимами поверхностного слоя жидкости показывает, что при применяемых количествах 200 мг проназы и 15 мг панкреатина они удаляют большую часть белковых примесей, следующий по эффективности субтилизин после папаина и бромелаина. Самые плохие результаты получают со свиной пептидазой. Белковые примеси, оставшиеся после переваривания с панкреатином и бромелаином, наиболее легко удаляют ионообменной хроматографией на ДЕЛЕ-целлюлозе.П р и м е р 2. 408 г свежей печени смешивают с 816 мл 0,025 М трис (тройной буфер),рН 7,5, в 0,3 сахарозы и 0,05 М КС 1.Суспензию центрифугируют в течение 1 ч. Мутный верхний слой жидкости имеет объем 800 мл и рН - 6,3.100 мл порцию верхнего слоя жидкости, содержащую 15 - 30 мг орготеина, подвергают в течение 2 дней при 37 С дигерированию (перевариванию) с некоторым количеством протеолитического энзима, с добавлением азида натрия (0,1%) как предохраняющего средства с последующим диализом.Лучший результат получают с панкреатином, прон азой и субтилиз ином, остаточный протеин легко удаляют из панкреатиновой выварки путем ионнобменной хроматотрафии с ДЕЛЕ-целлюлозой.П р и м е р 3. 300 г печени смешивают с 600 мл 0,025 М тройного буфера 0,025 М глизина в 0,01 М Мп, рН 7,5.Смесь (шлам) центрифугируют. Остаток намного лучше уплотняется в этом буфере. Верхний слой жидкости (110 мг протеина) мл измеряется в 570 мл. Порцию подвергают фер 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 ментному перевариванию с,панкреатином или проназой и подвергают диализу с целью отделения орготечна от деградированных протеинов,У панкреатина приблизительно одинаковая эффективность при все: испытуемых концентрациях (3 - 150 мг/мл). Пропаза менее эффективна, когда разведена от 2 мг/мл до 0,02 или 0,04 мг/мл.Прим ер 4, 300 г бычьей печени смешивают с 0,025 М тройного буфера, 0,025 мг лицина в 0,01 М Мп, рН 7,5 в соотношении 2 мл буфера,на 1 г печени. Шлам центрифугируют в течение 1 ч (экстрагированные протенны, 60 г/л поверхностного слоя жидкости; орготеин приблизительно 150 мг/л). Приготовляют раствор панкреатина (100 мг/мл) в 0,05 М тройной НС 1 - буфер, рН - 7,5.Верхний слой жидкости экстракта бычьей печени (рН 6,7) титруют до 7,5 рН с помощью 1 М тройного буфера, К каждым 100 мл экстракта бычьей печени добавляют 6 мл (0,6 г) раствора панкреатина и 1 мл 10% азида натрия, Смесь (рН - ,5) инкубируют при 37 С в течение 2 дней, в течение которых цвет смеси меняется от красного до коричневатого (остаточный протеин, около 3 г,л, орготеин приблизительно 150 мг/л). Выдержанную смесь подвергают диализу через деионизированную воду в течение ночи и наконец в 0,005 М фосфатного буфера рН 6,0.Диализатцентрифугируют в течение 1 ч и затем отфильтровывают через микрофильтр.Фильтрат имеет рН 6,3.Содержание орготеина в протеинах оставшееся в них, более чем 5/о по оравнению с 0,2/о в растворимых протеинах, экстрагированных из исходного шлама.Чистый орготеин удаляют из фильтрата, Диэтиламиноэтилцеллюлозную ионообменную колонку наполняют до 8,5 мл объема слоя. Уравновешивают 0,005 М фосфатным буфером, рН 6,0. Скорость протока 20 мл в час.253 мл фильтрата, эквивалентных 82 г печени, загружают в эту колонку. Колонку потом промывают 30 мл 0,005 М фосфатного буфера с рН - 6,0, Орготеин подвергают элюированию с линейным градиентом от 0,005 М фосфата, рН 6, до 0,005 фосфата в 0,075 рН 6,0, в общем объеме 170 мл. Трубки, содержащие орготеин, без примесей помещают в одну фракцию, а те, которые содержат орготеин вместе с некоторыми примесями - в другую фракцию. Обе фракции, каждая диализировалась, стабилизируют давлением сахарозы, если необходимо, фильтруют и лиофилизируют.Выход чистого орготеина 27,6 мл (0,034/о) в расчете на исходное количество печени; 62 о/о от теоретических. Выход чистого орготеина 10 мг, давая общий выход орготеина 84/о от теории.Чистый орготеин может быть рециркулирован или.далее очищен путем воздействия друРедактор Э. Шибаева 1(орректор Е. Хмелева Заказ 2489,19 Изд.1776 Тираж 575 Подписное ЦИИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР ио делам изобретений и открытий 113035, Москва, )К, Раушскан ваб., д. 4/5гипографии, пр. Сапунова, 2 гих протеолитических энзимов, например, проиазы, или геленой, или иоиообмеииой хроматографией.Г р и м е р 5. Чтобы определить эффект проведения стадии протеолитического дигерирования на различных стадиях отделения орготеина, вся бычья печень, растворимые протеииы из бычьей печени и растворимые протеииы из бычьей печени, обработанные теплом, подвергают ферм ентной очистке панкреатииом. Чтобы получить экстракт растворимых протеинов из бычьей печени, 500 г (150 г твердых веществ) бычьей печени смешивают в смесителе с одним литром буферного раствора 0,25 М тройного, 0,025 М глицина и 0,01 М Мп, рН - 7,5, чтобы получить 1380 г/мл смеси, 100 мл порции полученной смеси подвергают обработке по стадиямА. Смесь центрифугируют, в течение 1 ч, получая 78 мл поверхностного слоя жидкости, содержащей 100% растворимых протеинов и 100% орготеина в исходной печени.Б. 78 мл поверхностного слоя жидкости из стадии А подвергают протеолитическому разрушению с помощью 300 мг панкреатина, рН - 7,5; 37 С; 24 - 28 час. 100% орготеина и10% общих растворимых протеинов исходной печени остаются.В. 100 мл исходной печеночной смеси подвергают тепловой обработке при 65 С в течение 15 мнн, охлаждают и центрифугируют, получая 78 мл верхнего слоя жидкости и 7,6 г/ 189,5% ) осажденных нерастворимых протеи нов,78 мл поверхностного слоя жидкости затемподвергают обработке энзимами стадии 100% орготеина и (6% общих растворимых протеинов исходной печени остаются.Г. 78 мл поверхностного слоя жидкости ста дии А подвергают тепловой обработке стадии В. Выход от центрифугирования 60 мл 12,70 г твердых веществ) поверхностного слоя жидкости и 2,05 г осадка. 60 мл поверхностного слоя жидкости затем подвергают обра ботке протеолитическими энзимами стадии Б.Остается 3 - 6% растворимых протеинов. Тепловая обработка перед стадиями энзимной обработки делает последнюю более эффективной, потому, что на стадиях В и Г остается 20 только 3 - 6% растворимых протеинов, тогдана стадии В остается больше чем 6%,Формула изобретенияСпособ получения орготеина из экстрактов 25 животных тканей путем хроматографическогофракционирования, о тл и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения степени чистоты целевого продукта, экстракт предварительно обраб 1 гывают п 1 ротео,пити 1 еским ферео,