Способ выделения урокиназы из биологических источников

СОЮЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНИХРЕСПУБЛИН 19) Я ИСАНИ ЕТ ТЕЛЬЦЕ У ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ(54)(57) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ УРОКИНАЗИЗ БИОЛОГИЧЕСКИХ ИСТОЧНИКОВ, включающий гидрофобную хроматографию,о т л и ч а ю щ и й с я тем, что,с целью увеличения удельной активности целевого продукта, хроматографию проводят дважды на колонкес бензилсефарозой в присутствии202-ного сульфата аммония, а элюциурокиназы осуществляют формиатнымбуфером рН 4,0, причем первую сорбцию урокиназы на носителе осуществляют при рН 7,0, а вторую - прирН 4,0 с последующей гель-фильтраИз обретение о ферме е ског бу по йвм зводбопроитромнно, к тносится к ратов а име киназьнтныхо дейлучениедицин препаствия ствулитич спосо няемо я уроской име- препрке,практи бо эмб.о ственно при тромеваниях. имуще забол лических 5 Известен способ выделения урокиназы, включающий очистку фермента1 Ос использованием сульфатаммонийного осаждения, многократного, центрифугирования, гельфильтрации на сефадексах, ионообменной хроматографии,1 1.Недостатки способа состоят в мно 15гостадчйности, трудоемкости и длительности процедуры.Наиболее близок к предлагаемомупо технической сущности и достигаемому результату способ очисткиурокиназы, включающий гидрофобнуюи аффинную хроматографию биологических источников фермента 2 1.Основные недостатки способа заключаются в необходимости предварительной концентрации выделяемого фермента и использовании обогащенныхбиологических источников.Бель изобретения - увеличениеудельной активности целевого продукта.Поставленная цель достигаетсятем, что согласно способу выделенияурокиназы из биологических источников, включающему гидрофобную хроматографию, хроматографию проводятдважды на колонке с бензилсефарозой в присутствии 207.-ного сульфата аммония, а элюцию урокиназы осуществляют формиатным буфером рН 4,0, 40причем первую сорбцию урокиназына носителе осуществляют при рН 7,0,а вторую - при рН 4,0 с последующей гель-фильтрацией,Использование гидрофобного носителя позволяет избирательно и прак.тически полностью извлечь фермент,а путем изменения условий сорбциипри повторной хроматографии удаляются балластные белки. 50Способ в ыделени я урокина эы о существляется следующим образом.К среде кондиционирования клетокпочек человека ВН добавляют сульфат аммония до 203-ного насыщения 55и доводят рН раствора 1 М трис до7,0.,Раствор пропускают через колонку, упакованную гидрофобным сорбентом и бензилсефароэои и уравноэешенную 0,1 М трис-НС 1 буфером 7,0, содержащим 0,4 Г 1 1 аС 1 и 207. сульфата аммония. Колонку промывают уравновешивающим буфером и элюируют урокиназу формиатным буфером рН 4,0.На второй стадии к элюату добавляют сульфат аммония до 207.-ного насыщения, сорбируют его на той же колонке с бензилсефарозой, уравновешенной 0,05 М формиатным буфером рН 4,0, содержащим 207. сульфата аммония, Колонку промывают уравновешивающим буфером. Урокиназу элюируют 0,05 М формиатным буфером рН 4,0.Окончательную очистку осуществляют гель-фильтрацией на ультрагеле АсА 54. Белки элюируют 0,05 М трис-НС 1 рН 7,5, содержащим 0,2 М ГаС 1. Фракции, содержащие урокинаэу, диалиэуют и лиофильно высушивают.П р и м е р 1. К 1 литру среды кондиционирования культуры клеток почек человека КН, содержащей 35 МЕ урокиназы намл, добавляют 106 г сульфата аммония до 207-ного насыщения, подводят рН до 7,0 1 М трис. Раствор наносят на колонку 1 7 см, упакованную 20 мл бензилсефарозы, которая предварительно уравновешена О,1 М трис-НС 1 буфером рН 7,0, содержащим 0,4 М ГаС 1 и 207. сульфата аммония. Все процедуры проводят при комнатной температуре. Скорость нанесения среды кондиционирования 250 мл/ч. Колонку промывают с такой же скоростью уравновешивающим буфером до полного прекращения вымывания красителя, содержащегося в сре - де кондиционирования, и белков, не связавшихся со смолой. Урокиназной активности в этих фракциях не обнаружено. Связанный на колонке фермент элюируют 0,05 М формиатным буфером рН 4,0 со скоростью 40 мл/ч.Удельная активность урокиназы после первой стадии очистки составляет 3800 МЕ/мг. Выход 927,.На второй стадии к 16 мл полученного раствора урокиназы добавляют 1,6 г сульфата аммония до 207-ного насыщения. Вторую хроматографию проводят на той же колонке с бензилсефарозой, но уравновешенный 0,05 М формиатным буфером рН 4,0, содержащим 207. сульфата аммония.1175965 Составитель В,КузьмичевРедактор Л.Пчелинская Техред С.Мигунова Корректор И.Муска Заказ 5312/30 Тираж 525 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб д, 4/5Филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 После нанесения раствора белка колонку промывают 100 мл уравновешивающего буфера со скоростью 250 мл/ч, после чего урокиназу элюируют 0: 05 М формиатным буфером рН 4,0 со скоростью 40 мл/ч.Удельная активность урокиназы после второй стадии очистки составляет 42000 МЕ/мг. Выход 76%.Сконцентрированный ультрафильтрацией на амиконе (Фильтр РМО ) до 2 мл раствор урокиназы наносят на колонку 1 57 см, упакованную . ультрагелем АсА 54 и уравновешенную 0,05 М трис-НС 1 буфером рН 7,5, 15 содержащим 0,2 М МаС 1, Скорость злюции белков 7 мл/ч, Фракции, содержащие урокиназную активность, диали-. зуют и лиофильно высушивают.Удельная активность препарата 20 после последней стадии очистки составляет 190000 МЕ/мг. Выход 64%.П р и м е р 2. Ц качестве исходного сырья используют обедненную среду кондиционирования культуры .25 клеток почек человека КН, содержащую 3 МЕ урокиназы на 1 мл.На первой стадии аналогично примеру 1 получают урокиназу с удельной активностью 3350 МЕ/мг. Выход 95%.Удельная активность урокиназы после второй стадии очистки составляет 38000 МЕ/мл. Выход продукта 70%.После последней стадии очистки удельная активность урокиназы35 120000 МЕ/мл, Выход 68%. 4П р и м е р 3. Третьи порции среды кондиционирования культуры клеток почек человека ЙН объемом по 200 мл каждая с суммарной активностью урокиназы 5600 МЕ/мл ( удельная активность 28 МЕ/мл) обрабатывают аналогично примеру 1 на первой стадии хроматографии, но с измененной конечной концентрацией сульфата аммония на каждую порцию соответственно 10, 20 и 30%. Выход продукта соответственно составляет 41,92 и 89% с активностью урокиназы в каждой конечной порции:2300, 5150 и 5000 МЕ/мл. Максимальный выход продукта достигается при концентрации сульфата аммония 2 О%.Предлагаемый способ обеспечивает получение препарата урокиназы из обедненных сред кондиционирования, содержащих урокиназу до 3 МЕ/мл, отличается быстротой очистки ( до 1 сут )и высокой удельной актив - ностью получаемого препарата урокиназы в результате исключения нескольких трудоемких процедур, таких как предварительная концентрация, диализ и центрифугирование, так как одновременно осуществляется концентрация и очистка фермента. По сравнению с известными предлагаемый способ значительно упрощен, поскольку на двух стадиях процесса используется одна и та же хроматографическая колонка.