Способ выделения анионных фосфолипидов

(51) 4 С И ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТН А ВТОРСНОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ смеа т,бретение о х соединени лучения инди а именно к споидуальных фосфои 1 ш СУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ(71) Московский ордена Трудового Красного Знамени институт тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова,Институт биологической и медицинскойхимии АМН СССР и Харьковский заводбактериальных препаратов(56) Копвег 6., Кт 1 гсЬечв 1 су С, ег а 0.Ь 1 рЫ сошров 1 т.акоп о 1 Ьее 1 Ьго 1 п, Ьеей11 чег, апй Ье веа апешопе: Ого арргоасЬев го 1 паптхтадче Ггастдопатгоп о 1 сошр 1 ех .11 рЫ ш 1.хгитев. - .1.Хает. 01 СЬешдвСв Бос., 1963, ч,40,р, 425-452.(54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ АНИОННЫХ ФОСФОЛИПИДОВ(57) Изотносится к химииприродны й,собам по в липидов, может быть применено в изучении структуры и функций клеточныхмембран и для приготовления липосомальных препаратов, биологически активных эмульсий, антигенных препаратов для диагностики сифилиса. Цельизобретения - повышение чистоты ивыхода продукта достигается тем,чтоиспользуют адсорбент, позволяющий сочетать ионообменную и афинную хроматографию и подбирают растворители длэлюирования . Для этого разделялиси фосфолипидов из мора крупного рога. Свежий мозг гомогенизируют в системе хлороформ - этанол (1.1), ост -ток экстрагируют в той же системе(2:1). Полученный суммарный экстраксодержащий фосфолипиды, адсорбируютна колонке с макропористым силикагелем, содержащим неомицил или Ь-лизин. Для элюирующих систем используютрастворы формиата аммония в системехлороформ - метанол - вода (1:2:0,4)или систему, содержащую хлороформ -метанол - муравьиную кислоту в соот 1284981 2Изобретение относится к химии природных соединений, конкретно к способам получения индивидуальных фосфолипидов, и может быть использованопри изучении структуры и функций клеточных мембран, а также для приготовления липосомальных препаратов,биологически активных эмульсий, антигенных препаратов для диагностикисифилиса.Целью изобретейия является повышение чистоты и выхода продукта.Цель достигается за счет используемого адсорбента позволяющего сочетать элементы афинной и ионообменной хроматографии, и подбора системрастворителей для элюирования.П р и и е р. 1. Разделение смесифосфолипидов из мозга крупного рогатого скота.Свежий мозг 110 г) гомогенизируютв 200 мл системы хлороформ-метанол(1:1), а остаток повторно экстрагируют 200 мл системы хлороформ - метанол (2:1), Полученный суммарныйэкстракт, содержащий 0,45 г фосфолипидов, наносят на колонку с,макропористым силикагелем МПС-ВГХ,содержащим неомицин, присоединенныйизвестным способом. Объем адсорбента 20 мл,Для приготовления элюирующихсистем используют растворы формиатааммония в системе хлороформ - метанол - вода (1:2:0,4).После нанесения смеси фосфолипидов через колонку пропускают 60 млсистемы хлороформ - метанол (1:1).Полученная фракция содержит 0,181 гнейтральных липидов, Затем через колонку пропускают 60 мл системы хлороформ - метанол (1:2). Полученнаяфракция содержит следы нейтральныхлипидов, а также 0,146 г смеси ФосФатидилхолина и фосфатидилэтаноламина. После этого колонку промывают120 мл системы хлороформ - метанол -муравьиная кислота (1:2:0,1). Полученная Фракция содержит 0,0045 г ФосФатидной кислоты, выход 99% от исходного содержания, чистота 100%.Затем колонку промывают 120 мл системы хлороформ - метанол - муравьичая кислота (1:2:0,2). ПолученнаяФракция содержит 0,081 г Фосфатидилсерина, выход 99% от исходного содержания, чистота 100%, Далее колонку промывают 40 мл системы хлороформ - метанол - вода . (1: 2: О, 4)для удаления с колонки остатков муравьиной кислоты, затем 120 мл 0,02 Мраствора формиата аммония. Полученная фракция содержит 0 0225 г моноФосфоинозитида, выход 99% от исходного содержания, чистота 100%. После.этого через колонку пропускают 120 млО, М раствора Формиата аммония, По лученная фракция содержит 0,0034 гкардиолипина, выход 99% от исходногосодержания, чистота 100%, Далее через колонку пропускают 120 мл 0,4 Мраствора Формиата аммония, Получен ная фракция содержит 0,0032 г дифосФоинозитида, выход 99% от исходногосодержания, чистота 100%. В заключение колонку промывают 120 мл 1 Мраствора формиата аммония. Получен ная фракция содержит 0,0034 г триФосфоинозитида, выход 99% от исходного содержания, чистота 100%.П р и м е р 2. Разделение смесимоно-, ди- и трифосфоинозитидов, выделенных из мозга крыс.Образцы моно-, ди- и трифосфоинозитидов растворяют в 10 мл системыхлороформ - метанол (1:1) и полученный раствор, содержащий 0,09 г суммарных фосфолипидов, наносят на колонку с макропористым силикагелемМПС - 1000-ВГХ, содержащим неомицин, присоединенный известным способом. Объем адсорбента 5 мл.Для приготовления элюирующих систем используют растворы формиата аммония в системе хлороформ - метанол - вода (1:2:0,4),После нанесения смеси фосфолипидов через колонку пропускают 15 мл системы хлороформ - метанол (1:1) для удаления следов нейтральных липидов, Фосфатидилхолина и Фосфатидилэтаноламина и 15 мл системы хлороФорм - метанол - муравьиная кислота (1:2:0,05) для удаления следов фосФатидной кислоты и фосфатидилсерина.Далее колонку промывали 10 мл системы хлороформ - метанол - вода (1:2: :0,4) для удаления с колонки остатков муравьиной кислоты, затем 30 мл 0,01 М раствора формиата аммония, Полученная Фракция содержит 0,03 г монофосфозитида, выход 99% от исходного содержания, чистота 100%. Затем колонку промывали 30 мл 0,4 М раствора формиата аммония, Полученная фракция содержит 0,029 г дифосфоино 3 12849зитида, выход 99% от исходного, чистота 100% . В заключение колонку промывают 30 мл 1 М фосфора формиатааммония. Полученная фракция содержит0,03 г трифосфоинозитида, выход 99% 5от исходного, чистота 100%.П р и м е р 3. Вьделение монофосфоинозитида из пекарских дрожжей,Суммарный липидный хлороформно-метанольный (1:1) экстракт, содержащийоколо 0,5 г липидов, полученный изпекарских дрожжей известным способом, наносят на колонку с макропористым силикагелем МПС - 1000-ВГХ, содержащим неомицин, присоединенный известным способом. Объем адсорбента5 млфПосле нанесения смеси фосфолипидов через колонку пропускают по 30 мпсистемы хлороформ - метанол (1:1) и 2030 мл системы хлороформ - метанол(1:2). Полученные фракции содержат0,44 г нейтральных и цвиттерионныхлипидов (Фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин и их лизопроизводные).После этого колонку промывают 30 млсистемы хлороформ - метанол - муравьиная кислота (И 2:0,2), получая0,01 г Фосфатидилсерина. Затем колонку промывают 10 мл системы хлороформ - 30метанол - вода (1:2:0,4) для удаления с колонки остатков муравьинойкислоты и в заключение 30 мл 0,01 Мраствора формиата аммония в системехлороформ - метанол - вода (1:2:0,4)35Полученная Фракция содержит 0,05 гмонофосфоинозитида, выход 99% от исходного содержания, чистота 100%,П р и м е р 4. Выделение кардиолипина из сердечной мьппцы крупного40рогатого скота,Сердечную мышцу (80 г) гомогенизируют с 600 мл ацетона, а остатокдважды экстрагируют 600 мл метанола.Метанольный экстракт, содержащий450,4 г суммарных фосфолипидов, упаривают, остаток растворяют в системехлороформ - метанол (1:1), отфилыровывают и наносят на колонку со сфероном Р(оксиэтилметакрилатныйгель); содержащим неомицин, присоединенный известным способом. Объем адсорбента 5 мл.После нанесения смеси Фосфолипидов через колонку пропускают 30 млсмеси хлороформ - метанол (1:1) и30 мл смеси хлороформ - метанол (1:2),вымывая фракции, содержащие,нейтраль 81 4ные и цвиттерионные липиды (фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин и ихлизопроизводные). После этого 30 мл,смеси хлороформ - метанол - муравьиная кислота (1:2:0,2) вымывают фосфатидилсерин. Затем колонку промывают 10 мл системы хлороформ - метанол -вода (1:2:0,4) для удаления с колонкиостатков муравьиной кислоты и в заключение 30 мл 0,05 М раствора формиата аммония в системе хлороформ -метанол - вода (1:2:0,4), Полученнаяфракция содержит 0,033 г кардиолипина, выход 99%, чистота 100%.П р и м е р 5. Вьделение кардиолипина из сердечной мышцы крупногорогатого скота.Раствор суммарных фосфолипидовсердечной мьпццы в системе хлороформ -метанол (1:), полученный как описано в примере 4, наносят на колонкус макропористым силикагелем МПС 1 ООО-ВГХ, содержащим .-лизин, присоединенный известным способом. Объемадсорбента 5 мл.После нанесения смеси фосфолипидов через колонку пропускают 30 мпсистемы хлороформ - метанол (1:)и 30 мл системы хлороформ - метанол1:2), Полученные фракции, содержатнейтральные и цвиттерионные фосфолипиды (фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин и их лизопроизводные),После этого системой хлороформ - метанол - муравьиная кислота (1:2:0,2)вымывают фракцию, содержащую фосфатидилсерин, Затем колонку промывают10 мл системы хлороформ - метанол -вода (1:2:0,4) для удаления с колонки остатков муравьиной кислоты и взаключение 30 мл 0,02 М раствора формиата аммония в системе хлороформ -метанол - вода (1:2:0,4) . Полученнаяфракция содержит 0,033 г кардиолипина, выход 99%, чистота 100%.П р и м е р б. Вьделение кардиолипина из сердечной мышцы крупногорогатого скота.Раствор суммарных фосфолипидовсердечной мьшды в системе хлороформметанол (1:1), полученный как описано в примере 4, наносят на колонкус аминосилохромом 350/80. Объем адсорбента 5 мл,После нанесения смеси Фосфолипидов через колонку пропускают 30 млсистемы хлороформ - метанол (1:1) и30 мл системы хлороформ - метанол128498 1 Бсного содержания в ткани, чистота902,Формула изобретения Составитель А. ПереверзеваРедактор Н. Гунько Техред А.Кравчук Корректор С. Шекмар Заказ 7557/26 Тираж 347 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб д. 4/5(1:2). Полученные фракции содержат нейтральные и цвиттерионные липиды (Фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин и их лизопроизводные), После этого 30 мл системы хлороформ - ме танол - муравьиная кислота (1:2;0,2) вымывают фосфатидилсерин. Затем колонку промывают 10 мл системы хлороформ - метанолвода (1:2:0,4) для удаления с колонки остатков муравьиной кислоты и в заключение 30 мл О,1 М раствора Формиата аммония в системе хлороформ - метанол - вода (1:2:0,4). Полученная Фракция содержит 0,033 г кардиолипина, выход 99715 от исходного содержания, чистота 1003,Предлагаемый способ позволяет выделить из сложных сйесей .Фосфолипидов за одну, стадию индивидуаль ные анионные фосфолипиды с выходом 99 и чистотой 1007, тогда как по известному способу выход анионных фосфолипидов составляет 90 Е от исходСпособ выделения анионных фосфолипидов путем хроматографирования экстрактов природного сырья на твердых носителях с использованием для элюирования систем на основе хлороформа и метанола, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышения выхода и чистоты продукта, экстракт, содержащий смесь фосфолипидов, наносят на колонку с аминосилохромом или макропористым силикагелем, модифицированным неомицином или Ь-лизином, а элюацию осуществляют системой содержащей хлороформ - метанол - муравьиную кислоту в объемном соотношении 1:2;(0,05-0,2), или системой, содержащей 0,01-1 М раствор формиата аммония в смеси растворителей хлороформ - метанол - вода в объемном соотношении 1:2:0,4.