Способ количественного определения стероидных гормонов в биологических субстратах

СОЮЗ СОВЕТСКИХХЮЮЮЯюипаиЕСПУБЛИК 8 а 01 В 33 всйз птах,щ ПИСАН ТЕН ТВУ о УДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ ССОРДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ ТОРСНОУ 6 ВЩВТГЛ(71) Институт питания АМН СССР(56). 1. Авторское свидетельство ССВ 288867, кл. О 01 Н 33/48, 1971.2. Авторское свидетельство СССРВ 438928, кл. 6 01 И 33/48, 1974.3. Патент франции В 2396975,кл. О 01 В 33/16, 1979.(54)(57) СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕцЕЛЕНИЯ СТЕРОИДАХ ГОРМОНОВ ВБИОЛОГИЧЕСКИХ СУБСТРАТАХ вклочающпроведение экстракции исследуемогсубстрата и количественное биохими.801012 ческое измерение содержания стероидных гормонов, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью снижения трудоемкости способа путем одновременного определения эстрадиола .- 1713, эстрона и эстриола в одной пробе и повышения точности, экстракцию проводят с помощью смеси спиртов с по.следукщим пропусканием полученного продукта через целнтовую колонку, проводят гидролиз полученного экстракта, очищают полученный гидролизат и затем разделяют искомые стероиды с помощью адсорбционной хроматографии на микроколонке из А 10 З и распределительной хроматографии, после чего проводят их количественное биохимическое измерение.45 Изобретение относится к способам определения стероидных гормонов.Известны способы раздельного определения зкстрадиола, тестостерона и др. ( 11 н ) 2(.Однако известные способы не прз воляют вести одновременное определение нескольких стероидных гормонов в одной пробе.Известен также способ одновремен" ного определения гормонов в пробе, 10 включакщнй экстракцню субстрата, очистку получаемого экстракта и последующее биохимическое измерение содержания гормонов3.Однако этот метод трудоемок, не достаточно точен, не позволяет вести определение связанных форм стероидов.Целью изобретения является снижение трудоемкости способа путем одновременного определения эстрадиолаф 20 эстрона и этриола в одной пробе и повышение точности способа.Цель достигается тем, что соглас.но способу количественного определения стероидных гормонов в биологических субстратах, включающему проведение экстракции исследуемого субстрата и количественное биохимическое измерение содержания стероидных гормонов, экстракцию проводят с помощью смеси спиртов с последующим пропусканием полученного продукта через целитовую колонку, проводят гидролиз полученного экстракта гидролизата и последующее разделение. искомых стероидов с помощью адсорбционнойхроматографии на микроколон" ке из А 10 ь и распределительной, хроматографии, после чего осуществля. ют их количественное биохимическое измерение. 40П р и м е р . Экстракцию из тка" ней животных (мышц, печени, почек и др.) проводят в 2 этапа. Сначала тщательно измельченную ткань (150- 200 г) экстрагируют в скоростном смесителе смесью полярных растворителей: этанол-метанол-вода (1:1:0,6) 300-400 мл, Остатки ткани отделяют фильтрованием через бумажный фильтр, фильтраты объединяют (1 этап). Затем тканевые остатки смешивают с целитом (1)-3 веса ткани) и смесь переносят на колонку (используют колонку размером Зх 30 см). В колонку вносят экстрагент: этанол-метанол (1:1) и экстрагируют в течение 9- 10 ч ( П этап экстракции). Экстракты объединяют и концентрируют на роторном испарителе до объема 100- 150 мл. Выпавший осадок отделяют фильтрованием и отбрасывают.Кислотный гидролиз. К экстракту добавляют соляную кислоту до концентрации 12 и гидролизуют 30 мин при 75 С. К гидролизату добавляют 2 объема дистиллированной воды, добавлением 65 2 н.БаОН доводят рН до 5,5 и дважды экстрагируют равным объемом эфира. Эфирные экстракты объединяют, фильтруют через На 804 и выпаривают в вакууме досуха.Хроматографнрование на колонке А 1 ОЗ. Перед хроматографией А)Оь обезвоживают (при 180 ф в течение 4 Ч) затеи адсорбент стандартизируют до- . бавлением 10 воды и встряхивают в течение 2 ч, А 10 суспендируют в хлороформе и формируют колонку размером 6,0 х 0,5 см. Колонку промывают 20 мл хлороформа и на нее наносят исследуемую пробу. Элюцию осущест- . вляют: 10 мл хлороформа (фракция 1 - не содержит стероидов), 15 мл 0,5 этанола в хлороформе (фракция 2 - содержит эстрон), 15 мл 3 этанола в хлороформе (фракция 3 - содержит, эстрадиол%, 20 мл 20 этанола в хлороформе (фракция 4 - содержит эстриол). фракции, содержащие эстро- гены, выпаривают на роторном исйарителе до минимального объемаЭкстракция смесью полярных растворителейг этанол-метанол- вода. Гидролиз кислотный илиФерментныйЬХроматография на колонке А 1 Оъ4Хроматография в тонком слоесиликагеляГЖХ флюорометрия Радиоиммунологическое определение,Метод одновременного определенияэстрадиола, эстрона и эстриолав тканях животных проводят по следующей схеме.Хроматография в тонком слое сили"кагеля. Исследуемую пробу наносятна пластину силикагеля (20 х 20 см,толщина слоя 0,4 мм). Пластины пред-варительно активируют 50 мин, при120 . ТСХ проводят в системе растворителей; бензол"этилацетат (2:3).Элюцию с тонкого слоя осуществляютсмесью растворителей: этанол-бензол(3;1). Элюаты выпаривают на роторнойиспарителе,Количественное измерение. Предлагается 3 метода количественногоизмерения, каждый из которых с успе 4хом может быть применен в зависимости от конкретных условий.Флюорометрический метод наиболеедоступен: измерение флюоресценциипроводят иа спектрофлюорометре (любой марки)или же на отечественномфлюорометре типа СКБ с интерференционными светофильтрами. Для получения флюоресцирукщих производныхсухие остатки, соответствующие каж-1012138 Составитель А. МакаровТехредТ.фанта Корректор О. Билак Редактор М. Товтин М Заказ 2751/54 Тираж 871 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д, 4/5филиал ППП еПатент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 дому из исследованных стероидов растворяют в 0,3 мл этанола и добав,. ляют 1,5 мл реагента 96% зтанолконцентрированная серная кислота (14) и прогревают в течение 5 мин при 60смесь охлаждают и выдержи" вают 40 мин при комнатной температуре. Затем измеряют флворесценцию. Максимум Флюоресценции для эстрона эстрадиолаВ и эстриола при500-520 нм (.Леое 475-495 нм). ,Чувствительность метода 0,04- 0,08 .мкг (для каждого из зстрогенов),ГЖХ способ количественного измерения основан на исследовании фтор производных стероидов (детектор эле ктронного захвата). Для получения Фторпроизводных, сухой остаток, соответствующий эстрону или эстрадно" лу, растворяют в 0,5 мл бензола и добавляют 2 капли гептафтормасляного ангидридами.смесь прогревают при .70 в течение 40 мин и высушивавт под струей азота.При Фторировании от каждого иэ эстрогенов Bолучавт несколько фторпроиэводных. Применение тонкослойной хроматографии на силикагеле позволяет выделить дигептафторбутираты.стероидов, которые в дальнейшем измеряют методом ГЖХ.Тонкослойную хроматографию (двумер- ную) проводят в системах растворителей: безом-метиленхлорид-этнлаце" тат 2:1:1 и 1:1:2. При проведении,ГЖХ (хроматограф Цвет) в качестве жидкой фазы используют 3 ЯЕ нанесенную на хроматон, применяютстеклянные колонки - 2 м Тэфдф. 200Тдцр.э 230 ф Тдвтэктаупо ф Ь 5240 ф . В этих условиях время удер"живания эстрона.равно 8,2 мин, эстра;диола - 7,6 мин. ГЖХ анализ фторцроизводных позволяет определить 0,11,0 кг эстрогенаВ связи с тем, (О что эстриол дает большое число Фтор,производных (что затрудняет коли:чественное измерение) данный метоД:мы рекомендуем в основном для.эстрона и эстрадиола.15 Редиоимаунологический способ количественного определения основан наиспользовании радиоиммунологическихнаборов (Фирмы СЕЛРЕ-ЗОВИ и др.)после изложенной выше очистки экст рактов тканей. Метод позволяет определить 10-100 рд стероидов,.Варианты использования метода.Метод предназначен для определенияосновных биологически активных эстр 25 генов в тканях животных. Предлагаемые способы очистки и количественного измерения могут быть использованы также при исследовании зстрогенов в биологических жидкостях. Приэтом экстракция неконьюгированныхзстрогенов проводится с применениемобщепринятого зкстрагента - эфира