Штамм бактерий -20-продуцент глицеролдегидрогеназы, окисляющий глицерин в диоксиацетон

(9) (1); 4(50Т СССРОТКРЫТИЙ ПИСА ЗОБР ии иоиииииики ииде 1 епи(71) Всесоюзный научнотельский институт про(56) 1, Авторское свидетельство ССВ 418522, кл. С 12 Р 7/26, 1972.2. Авторское свидетельство СССР-исследовадуктов брожения ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМ ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИ(57) Штамм бактерий 01 цсопоЬасйег охуйапз 9-20 (коллекция Центрального музея промываеннык микроорганизмов Всесоюзного научно-исследовательского института генетики и селекции микроорганизмов., коллекционный но" мер ЦМПМ В) - продуцент глицеролдегидрогеназы,окисляющий глицерин в диоксиацетон.Изобретение относится к микробиологической промьпплености и представляет собой штамм культуры бактерийС 1 исопоЬасгегоху 4 апз 0-20 дляпромышленного получения диоксиацетата, применяемого в пищевой промышленности и медицине, Известна культура бактерий АсегоЬасгег асег 1-продуцент глицеролдегидрогенаэы, окисляющий глицерин в диоксиацетон Ц .Наиболее близка к предлагаемойкультура бактерий АсегоЪасйег БцЬохуйапз " продуцент внеклеточногоФермента глицеролдегидрогеназыкатализирующий окисление глицеринастрого избирательно по вторичной гидроксильной группе в диоксиацетон.Бактерии С.охудапз хорошо раэвариваются на средах с глицерином, который как источник углерода обеспечивает осуществление их энергетических и синтетических процессов. Этакультура хранится в коллекции микроорганизмов биологического факультетаЛенинградского государственного университета и является прототипом изобретения 2.Бактериальные клетки этой культуры имеют палочковидную форму, средние размеры клеток 0,5 - 1,2 мкм,размножаются делением, споры не образуют, склонны к образованию длин-,ных цепочек. Бактерии-каталазоположительные облигатные аэробы. Ассимилируют глюкозу, лактозу, мальтоэу,галактозу, глицерин, этанол, метанолпропанол и другие спирты. Характертерна ссобенность ассимилироватьуксусную кислоту. Этот штамм используется для получения уксусной кислоты на спирте, глюконовой или котоглю.коновой кислоты из глюкозы, сорбозыиэ сорбита. Штамм способен окислятьглицерин в концентрации не более2 Х до диоксиацетона при температуреоЗО.С в течение 48 ч. Выход диоксиацетона - 987, определенный по результатам анализа, Однако данный штаммне может найти промышленного применения для получения диоксиацетона всвязи с его неспособностью окислятьвысокие концентрации глицерина 127).В связи с этим процесс производства диоксиацетона с применением этогоштамма является низкопроизводительным,Целью изобретения является получение активного штамма С.охудапз, 20 способного окислять глицерин приконцентрации последнего в среде10-207.5Данный штамм был выделен-селекционным путем воздействия высокихконцентраций глицерина на исходнуюкультуру бактерий С.охудапз, полученную иэ Ленинградского государственного университета.Ниже приведена схема селекцииштамма С.охудапз Р=20:С 1 цсопоЬасгег охуйапз ЛГУОтбор на способность окислять67 глицеринаОтбор на способность окислять107 глицеринаОтбор на способность окнслять157 глицеринаОтбор на способность окислять207 глицерина, штамм С,охуйапз0=20Предлагаемый штамм Д=20 отличает.ся от исходного штамма не толькозначительно большей способностьюокислять глицерин, но рядом морфологических и физиологических признаков.Данный штамм хранится в коллекции Центрального музея промьппленныхмикроорганизмов Всесоюзного научноисследовательского института генетики и селекции под коллекционнымномером В,35Морфологические признаки.Бактериальные клетки имеют палочковидную Форму, средний размер клетки 0,6 х 1,2 х 1,6 мкм. Размножаются делением, спор не образуют,формирование цепочек наблюдаетсяредко. Инволютные формы проявляются в виде сильно увеличенных клеток .На агаризованной, среде с глицерином образуют мелкие выпуклые круглые гладкие блестящие колонии безпигментов. На поверхности жидкойсреды через 24 ч образуют тонкуюпрозрачную полисахаридную пленку,Физиолого- биохимические свойства .50Бактерии каталазоположительныеУоблигатные аэробы, Молодые клеткиграмотрицательны.Оптимальная температура дляокисления глицерина до диоксиацетата - 28-30 С, рН 5,5.55Отношение к углеводам. БактерииС,охудапз 0=20 хорошо ассимилируютглюкозу, мальтоэу, галактозу, рафФинозу.35 П р и м е р 2. Для проведения ферментации в укрупненных лаборатор б ных условиях посевной материал готовили следующим образом, Суспензию клеток односуточной культуры С.оху-. Еапз Э 20 из одной пробирки вносили в колбу Эрленмейера емкостью 750 мл, 55 снабженную четырьмя отбойниками, содержащую 100 мл питательной среды следующего состава, мас.%: Отношение к спиртам. Ассимилируют глицерин, этанол, метанол, пропанол, изопропанол, бутанол, изобутанол, пентанол, сорбит, маннит.Отношение к уксусной кислоте. 5 Не ассимилирует.П р и м е р 1, Окисление глицерина в диоксиацетон проводят следующим образом. Для подготовки посевного материала суспензию клеток С.охуЕапз 0=20 из одной пробирки (возраст культуры - одни сутки) в асептических условиях вносят в колбу Эрленмейера с четырьмя отбой- никами объемом 750 мл, содержащую 50 мл посевной среды следующего состава, мас.7:Глицерин 15,0Кукурузныйэкстракт20(50%- сухихвеществ) 1,252 0,3Мрто 0,029рН среды 5,5-5,725Выращивание посевного материала . проводят в течение 16-20 ч при 30 С до содержания диоксиацетона в среде 6,0-8,0%.Посевным материалом в количестве ЗО 2% засевают среду для ферментации следующего состава, мас.%: .Глицерин 15,0Кукурузныйэкстракт(507. сухихвеществ) 0,63КНРО 0,5рН среды 5,5-5,7Ферментационную среду разливают 4 п по 100 мп в колбы Эрленмейера четырьмя отбойниками объемом 750 мл. Ферментацию осуществляют на качалке (180 - 200 об/мин) в течение 48 ч. Содержание диоксиацетона в среде 4 14,4 - 14,77, что составляет выход 98-1007 от теоретического. ГлицеринКукурузныйэкстракт(507 сухихвеществ) 1 ф 5КЕЕ Р 04 0,3МАЗО 0,025рН среды 5,5-5,7Выращивание посевного материала осуществляют на качалке (180- 200 об/мин) при 30 С в течение 24 ч до накопления в среде 7,0-8,0% диоксиацетона.Окисление глицерина в диоксиацетон проводят в ферментере емкостью 30 л (рабочий объем 20 л), имеющем сульфитное число, равное 10 г Ол/ч .Питательная среда для фермента" ции имела следующий состав, мас.%:Глицерин 2 О, 0Кукурузныйэкстракт(50% сухихвеществ) 0,75КНРО, 0,5рН среды 5,5-5,7После стерилизации и охлажденияосреды до 30 С ее засевают посевным материалом в количестве 1%.Ферментацию осуществляют в те-" чение 72 ч при 30 С, За это время окисление глицерина до диоксиацетона проходит на 96%, что составляет 3,75 кгдиоксиацетона.Удельная производительность ферментера составляет 62,7 кг 100%-ного диоксиацетона с 1 мз оборудования в сутки.Удельная производительность фер-. ментера рассчитывается по формулевК и где- удельная производительность ферментераЕПг - количество глицерина,взятого на окисление, кгпвкоэффициент перевода рабочего объема ферментера. на .1 мф- выход диоксиацетона приокислении глицерина,- срок ферментации, сутки,1,02 - коэффициент пересчета глицерина на диоксиацетон.П р и м е р 3. В производственных условиях посевной материал гого. вят в инокуляторе емкостью 10 л,Ю ю Заказ 2810/2 . Тираж 525 Подписное ВЯИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 4ч Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул, Проектная, 4 .заполненном б л питательной среды,имеющей состав, как указано в примереДля засева инокулятора используюткультуру С.охуйапэ П=20, выращенную 5в колбе, как описано в примере 2.Ферментер емкостью 1 мф (рабочийобъем 600 л), снабженный якорной мешалкой, делающей 180 об/мин и обес,печивающей аэрацню 1 объем воздуха , 10на один объем среды в минуту, Производственная питательная. среда. дляферментации имеет состав, как.указано в примере 1.После стерилизации и послео15дующего охлаждения среды до 30 Сее засевает посевным материаломиз инокулятора. Ферментацию осуществляют в течение 72 ч. За это.время окисление глицерина проходит 26на 94,5 Х. Удельная нроиэводительность Ферментера составляет 47,5 кг/мв сутки,В таблице приведены сравнительные,показатели предлагаемого штамма с Ипрототипои,.Таким образом, преимущество предлагаемого штамма для промышленного получения диоксиацетона заключается в увефлнченни концеитрацнидиоксиацетона.,Предлагаемый штамм позволяет получать культуральную жидкость, содержащую высокие концентрации диоксиацетона, что упрощает процесс выделения конечного продукта, снижает трудоемкость процесса.