Способ получения эндонуклеазы рестрикции

УЦ 4 С 12 И 9/ 00 ОСУДАРСО ДЕЛ САНИЕ ИЗОБРЕТ СИОМЪ( СВ ЕЛЬСТВ А С, разФракферме 51 22 и ч.аю повы- стве азимо" ентааггапв но иссликладн п 6,тога говыращи содер 4,5-5,5 4,5-5,0 экстрактХлористыйнатрий ВЕННОЙ КОМИТЕТ СССР ЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЬПИЙ 707/30-152,829.85. Бюл. У 33Вайткявичюс, Б.П.Яскелявич А,Пунтежис и Э.-А.А.Янулай оюзный науч едов институт пр ой эн 155.2(088,8)осых В.Г. и др. "Выделение характеристика рестрикндонуклазы Есоп 11". Биохит. 47, с. 619-525. чев С.А. и др, "Рестрикндонуклаза Рая Х 1 из ТЬег( ) 07,(54)(57) 1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ РЕСТРИКЦИИ, включающий выра-щивание микроорганизма - продуцентафермента, обладающего способностьюузнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5 СС (А/Т)Срушение клеток ультразвуком,ционирование белков и очисткута путем хроматографии, о т лю щ и й с я тем, что, с цельщения выхода фермента, в качмикроорганизма-продуцента фериспользуют штамм МдсгососсцвЦМПВ В, а очистку фермеводят на Фосфоцеллюлозе Р 1110 мМ калий-Фосфатном буфере7, 1 и элюцией. градиентом хлоркалия 0,3-1,2 И.2. Способ по п, 1, о т лю щ и й с я тем, что штамм Мсоссцв чагдапв ЦИПИ В вают на питательной среде,жащей, г/л:Пептон 9,0 ДрожжевойИзобретение относится к микробиологической промыпденности, а именно, к производству Ферментов. ЭиЬонуклеаза рестрикции Ича 1 может быть использована для исследования первичной структуры ДНК и в генной инженерии.Известен способ получения эндонуклеазы рестрикции Есо К 11, узнающей и расщепляющей последователь ность нуклеотидов 5 СС(А/Т)СС, пре/дусматривающик культивирование штамма ЕясйегасЬьа со 1 д В 834/ря в среде ,следующего состава, г/л:дрожжевой экст 1 ракт - 5,0 пептон - 10,0 МаС 1 - 15 6,5, МНС 1 - 1,0, Ма,НРО+- 7,01 КН РО - 3,0, разрушение клеток в прессе ДКМ-З, фракционирование полиэтиленимином, осаждение белков сернокислым аммонием, диализ, хроматог рафию на ДЭАЭ целлюлозе в 10 мМ калий-Фосфатном буфере рН 7,0, содер.жащем 1 мМ ЭДТА, 7 мМ 2-меркаптоэтанол, 5 Х глицерин, хроматографию на Фосфоцеллюлозе, осеждение сернокис лым аммонием, гель-хроматографию на сефадексе С, рехроматографию на фосфоцеллюлозе и диализ Г 13. Эндонуклеаза рестрикции Есо К 11 узнает и расщепляет последовательность нуклео-З 0 тидов 5 СС(А/Т)СС, однако она не спо.собна расщеплять последовательность 5 СС (А/Т)СС (где С" - метилцитозин), что является серьезным недостатком, так как рекомбинантные молекулы ДНК,35 выделенные из штаммов Е.со 13., содержащих метилазу дев, расщепляются не полностью рестриктазой Есо К 11 изза частичного метилирования цитозинаФв узнаваемои последовательности.Другими недостатками известного способа является сложная и трудоемкая схема очистки и сравнительно низкий выход Фермента (6,600 ед/гбиомассы). 45Способ получения эндонуклеазы рестрикции Тая Х 1, узнающей пентануклеотид 5 СС(А/Т)СС, предусматривает культивирование штамма ТЬегшця а 8 цаСасця иа питательной среде, содержа щей 100 мп 1 Х ТУЕ (10 г триптона и 10 г дрожжевого экстракта в 1 л воды) 1 мп/л раствора микроэлементов Нитче (МьйзсЬе) (0,5 мп Н,Я 04, 2,2 г ИпЯО, 0,5 г ЕпЯО, 0,5 г Н,Р 055 0,016 г СцЯО, 0,025 г МаМоО 0,046 г СаС 1 "бН 20 в 1 л воды) и по 50 мп/л растворов А и Б Кастенгольца соответственно А;2,0 г нитроуксусной кислоты, 20,0 мл 0,037 РеС 1 1,2 г СаЯО 2 Н,О, 2,1 г КМО, в 1 л воды и Б 2 0 г МфЯ 7 Н О 0 16 гМаС 1 14,0 г МаМО 2,2 г Ма,НРО в 1 л воды) в 1 л воды, разрушение клеток ультразвуком, осаждение нуклеиновых кислот стрептомицинсульфатом, фракционирование белков сернокислым аммонием, хроматографию на ДЭАЭ-целлюлозе. в 20 мМ трис-НС 1-буфере рН 7,5, содержащем 0,5 мМ ЭДТА, 7 мМ 2-меркаптоэтанол, элюцию Фермента с колонки ДЭАЭ-целлюлозы градиентом МаС 1 0-0,4 М, диализ, хроматографию на гепарин-сефарозе в 20 мМ трис-НС 1- буфере рН 7,5, содержащем 0,5 мИ ДТА, 7 мМ 2-меркаптоэтанол, элюцию фермента с колонки с гепарин-сефарозой градиентом МаС 1 0-0,75 М, диализ. Получили 5 000-6 000 ед/г биомассы, Эндонуклеаза рестрикции Таз Х 1 расщепляет пентануклеотид 5 СС (А/Т)ССвне зависимости от наличия или отсутствия метилированного цитоэина(помеченного звездочкой) 23Однако способ получения эндонуклеазы Таз Х 1 имеет ряд недостатков:сравнительно невысокий выход Фермента (5 000-6 000 ед/г биомассьфсложную н трудоемкую схему очистки рестриктазы и.многокомпонентную питательнуюсреду культивирования штамма ТЬегшця араСсцз.Цель изобретения - повьппение вы- хода эндонуклеаэы рестрикции.Цель достигается способом получения эндонуклеазы рестрикции, включающим выращивание микроорганизма - продуцента Фермента, обладающего способностью узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов15 СС (А/Т)СС, разрушение клеток ультразвуком, фракционирование белков и очистку фермента путем хроматографии, отличающимся тем, что в качестве микроорганизма - продуцента фермента используют штамм Исгососсця чагхапя ЦИПМ В, а очистку Фермента проводят на Фосфоцеллюлозе Р 11 в 10 мМ калий-Фосфатном буфере рН 6,5-7, 1 и элюцией градиентом хлористого калия 0,3-1,2 М.Цель достигается способом, отличающимся тем, что штамм Мсгососсця чагапя ЦИПИ Ввыращивают на питательной среде, содержащей (г/л);1095645 3пептон 9,0-10,00, дрожжевой экстракт - 4,5-5,5, хлористый натрий -4,5-5,0.П р.и м е р, Используемый штаммМ 1 сгососсцз чаггапз ВГЕ 19 выделениз пищевода рогатого скота в Институте эпидемиологии, гигиены и микробиологии Литовской ССР. Штамм идентифицирован во ВНИИГПЭ и хранитсяв музее ВНИИгенетики под номеромЦМПМ В,Полученный штамм Мдсгососсцз чагдапз КГ 1. 19 обладает следующимиморфологическими, культуральными ифизиологическими признаками. Сферические клетки величиной 1,0-1,5 мкмв диаметре. В стандартных жидкихсредах клетки расположены в виденеправильных пучков, в парах или поодной. На МПа после 24 ч инкубации 2 Ов термостатепри 37 С образует круглые с ровными краями колонии 1,5 ммв диаметре, Колонии гладкие, с агаром не срастаются, желтоватогоцвета, В мясо-пептонном бульоне образует мутность. Оптимальная температура роста 37 С. При 45 С обычноВне растет. Грамположительные, каталазоположительные, Строгий аэроб.Желатину гидролизирует, Глюкозу иксилозу окисляет. Нитраты восстанавливают в нитриты, Резистентный к новобиоцину )2,0 мг/мл, Клетки неподвергаются лизису с лизоцимом приконцентрации его 100 мг/мп. Культурахранится в пробирках на среде МПА подовазелиновым маслом при +4 С,Полученная эндонуклеаза Мча 1 характеризуется следующими свойствами:узнает и специфически расщепляетпоследовательность 5 СС(А/Т)СС в молекуле ДНК;оптимальное значение рН для действия фермента 8,0-9,0;оптимальная температура действия30-40 С;для активации эндонуклеазы требуются ионы М+, их оптимальная концентрация 10-15 мМ.Получение эндонуклеазы Мча 1 изМ 1 сгососсцз чаг 1 апз РГЕ 1950Последовательность операций.Получение биомассы поддерживание посевного материала; 55выращивание посевногоматериала;культивирование штамма. 4Выделение и очистка рестриктазыразрушение клеток;хроматография на фосфо-целлюлозе.Для получения биомассы используютследующую аппаратуру: круговые термостатированные качалки, фотоэлектрокалориметр фЭКМ, лабораторный ферментер типа "Биолафит" и проточнуюцентрифугу С.Для поддерживания и культивирования штамма используют две среды;мясо-пептонный бульон (МПБ и МПА) ипитательную среду, содержащую, г/л:пептон - 10,0; дрожжевой экстракт -5,0 и ИаС 1 - 5,0, рН 7,0. Мясо-пептонный агар для поддержания и оживления штамма готовят по известным методам ("Практикум по микробиологии",1976) из мясо-пептонного бульона споследующим добавлением агара до27-ной концентрации рН 7,3-7,4, МПБ и,МПА стерилизуют при 0,8 атм 30 мин.МПБ оазливают в пробирки по 5 мл, аМПА - в чашки Петри. Питательнуюсреду для культивирования стерилизуют при 1 атм 20 мин.Штамм М 1 сгососсцз чаг 1 апз КГ 1. 19поддерживают в пробирках на средеМПА под вазелиновым маслом при +4 С.Для оживления Мдсгосоззцз чагдапзпересевают на МПА и инкубируют колонии при 37 С в течение 18-20 ч. Заотем бактериологической петлей пересевают в пробирку с 5 мп МПБ и инкубируют в термостатированной качалкес 250 об/мин при 37 С в течении 67 ч. Для засева ферментер на 10 лкультуральной среды готовят 0,5 линокулята (2 качалочные колбыпо 250 мл). В каждую колбу засеваютпо О, 1 мл 6-7 ч суспензии клеток.Выращивание инокулята проводятна круговой термостатированнойкачалке (250 об/мин) при 37 С 18 -20 ч. Оптическая плотность инокулята после выращивания составляето,5 смА о = 2,6-2,8 о.в. Полученный инокулят (0,5 л) засевают в ферментерс 9,5 л культуральной среды прирН среды 7,0 и 37 С. Выращиваниеопроводят с постоянной подачей воздуха в первые 2 ч выращивания 4 л/мин,последующие - 9-12 л/мин и постоянным перемешиванием в первые 2 ч300-400 об/мин, последующие -500 об/мин,Спустя 7-8 ч выращивание прекращают. Оптическая плотность культуральной жидкости составляет Адфф =34 0 щ 2,6-3,0, о. в., что соответствует концу логарифмической Фазы роста культуры.Культуральную жидкость охлаждают по +4 С и центрифугируют на проточоной центрифуге Спри 25 000 об/мин. Выход сырой биомассы: 2,3-3, 1 г/л культуральной жидкости.Для выделения и очистки рестриктазы используют следующую аппаратуру: ультразвуковой деэинтегратор типа МзЕ, центрифугу Бекман Ж 21 Ц, холодильную камеру "Колора", хроиатографическую колонку, термостат, аппарат для дискового электрофореза и унйверсальный источник питания УИП.ДНК фага 1 выделена по методике: ЗаЫо Н Мига К,Л. (ВдосЬещ. Вдо;рЬузАсса. 1963, 72, 619-629),При разрушении клеток используют буфер А (10 вы калий-фосфатный буфер рН 7,0, 10 иМ ЗДТА, 7 иМ 2-меркаптоэтанол, 0,15. М МаС 1, 1 мг/мл лизоцим), для хроматографии на фосфоцеллюлозе используют буфер Б (10 мИ калий-фосфатный буфер рН 7,0, 1 мМ ЭДТА, 7 мМ 2-меркаптоэтанол).Активность фермента определяют методом гидролиза ДНК фагас последующим разделением полученных фрагментов электрофорезом в стеклянных трубках с агарозныии гелями. Реакционная смесь для тидролиза содержит 75 мИ трис-НС 1, рН 8,5, 60 иМ ЯаС 1, 15 мМ МяС 1 , 70 мкг/ип альбумин, 2 мкг , ДНК в 40 мкл смеси и от 1 до 5 мкл фермента. Реакцию проводят при 37 С 1 ч. Электрофорез выпроводят в О, 1 М натрий-боратномбуфере, рН 8,2, 2 мМ трнлона Б, в течение 1 ч при напряжении 70 В и силе тока 4 мА на трубку. Окрашенныеэтидий бромидом (1 мкг/мп) гели просматривают в Уф-свете.За условную,единицу активности принимается то количество фермента,. которое в оптимальных условиях за1 ч полностью расщепляет 1 икг ДНК фага. 1 .Все операции по выделению и очист ке Фермента проводят при +4 С.3 г биомассы, полученной при культивировании Мсгососсцз чагдапз КРЬ 19, суспендируют в 12 мл буфера А, выдерживают 18 ч при +4 С, обрабатывают ультразвуком на дезинтеграторе мощностью 100 И в течение 6 мин и центрифугируют при 20 000 об/иин в течение 1 ч. В полученный бесклеточный экстракт добавляют сухой КС 1 до конечной концентрации 0,3 М и со скоростью 10 мл/ч наносят на колонку (1 х 10 си), с фосфоцеллюпозой Р 11, уравновешенной буфером Б, содержа 5 10 щим 0,3 М КС 1. Колонку промывают этим же буфером и фермент элюируютградиентом КС 1 (0,3-1,2) в буфереБ, Фракции с наибольшей эндонуклеазной активностью, элюируемые при 0,951,05 М КС 1, объединяют н диалиэируют 20 против буфера Б, содержащего 0,2 МКС 1 и 507 глицерин. Ферментный препарат хранят при -20 С. Из 1 г биомассы получают 200.000 единиц рестриктазы Мча 1. Определение последовательности нуклеотидов, узнаваемой эндонуклеазой рестрикции Мча 1.В опытах по определению последова 30 тельности нуклеотидов, узнаваемойэндонуклеазой Мча 1, быпи использованы ДНК ф Х 174, й и рВК 322, выращенные на,штаиме Е.со 1 з. НВ 101, содержащем метилазу Дев,35 40 45 личия или отсутствия метилированного цитозиыа, помеченного звездочкой.УаПредложенный способ получения эндонуклеазы рестрикции позволяет получить высокоочищенный ферментный препарат, повысить выход Фермента с 5 000-6 000 ед/г до 200 000 ед/г,50 55 Проведено расщепление этих ДНК эндонуклеазой Ича 1 эндонуклеаэой Тая Х 1 и совместное расщепление этими ферментами. Во всех случаях элект- рофореграммы совпадают с электрофореграммой, полученной после обработки только эндонуклеазой Тая Х 1, что указывает на то, что эти рестриктазы являются изошизомерами, т.е.расщепляет последовательность нуклеотидов 5 ССф(А/Т)СС независимо от на