Способ определения активности протеаз

(19) ИИ,СОЮЗ СОВЕТСНИСОЦИАЛИСТИЧЕСНРЕСПУБЛИН и 0 01,Ы 33И ,г . -3 Я ТВУ ТОРСИОМ В ЕТ ГОСУДАРСТВЕННЬЙ НОМИТЕТ СССР ГО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И (ЛНРЫТ ОПИСАНИЕ И(54) (57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ПРОТЕАЗ, включающий инкубирование люциферазы совместно спротеазой с последующим измерением уменьшения люциферазной активности образца и расчетом протеазной активности по константе инактивациилюциферазы, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышениячувствительности способа, инкубирование люциферазы с протеазой осуществляют при температуре 17-21 оСв течение 7-13 ч,55 Изобретение относится к биохимии и медицинской диагностике и предназначено для ,:змерения следовых количеств пс : аз, выделяемых из плазмы крови, а также иэ органов и тканей при медико-диагностическом и биохимическом исследовании.. Известен способ определения активности протеаз, включающий гидролиз белка казеината натрия препаратом фермента, который помещается в исследуемый, раствор, с последующей инактивацией фермента и осаждением непрогидролизованного белка трихлоруксусной кислотой. В полученном Фильтрате определяют количество прогидролизированного белка по содержанию образовавшегося тироэина колориметрическим . методом с применением реактива фолина. Протеолитическая активность препарата выражается в микромолях тирозина, образующегося в гидролиэате в.единицу времени 1 3.Однако этот метод трудоемок, многостадиен, обладает малой чувствительностью и неприменим для окрашенных, сильно поглошающих сред,Наиболее близким к изобретению по технической сущности и достигаемому эффекту чвляется способ определения активности протеаз, включающий инкубирование люциферазы совместно с протеазой с последующим измерением уменьшения люциферазной активности инкубируемого образца и расчетом протеазной активности по константе инактивации люцифера 1 эы Г 23Недостатком данного способа является низкая чувствительность (20 кг протеазы на образец ).Цель изобретения - повышение чувствительности способа.Поставленная цель достигается тем, что согласно способу определения активности протеаэ, включающему инкубирование люциферазы совместно с протеазой с последующим измерением уменьшения люциферазной ак-. тийности образца и расчетом протеаэной активности по константе инактивации люциферазы, инкубирование люциферазы с протеазой осуществляют при температуре 17-21 ОС в течение 9-13 ч.На фиг. 1 изображена зависимость предельной чувствительности метода от температуры, где по оси ординат отложены значения .натурального логарифма концентрации протеаэы (трип,син, нг/мл , по оси абсцисс - температура, на фиг, 2 - кривые изменения биолюминесцентной активности люциферазы в присутствии и отаутствйи прбтеазы (трипсин ), где по оси ординат показаны значения натурального логарифма интенсивности свечения в относительных единицах, пооси абсцисс - время в часах; нафиг. 3 - ипературная зависимостьминимального времени инкубированияпрепарата люциферазы с протеазой5 (трипсин, 5 нг/мп ).Для определения активности протеаэы сливают вместе исследуемый раствор протеазы и препарат люциферазы. Полученный образец помещают в10 термостат и отмечают время началаинкубации. В ходе инкубации черезопределенные промежутки времени производят измерения биолюминесцентнойактивности образца, для чего из пос 15 леднего отбирают аликвоты по 5 мкл.Полученные данные представляютв виде графика, откладывая по осиабсцисс время в минутах, а по осиординат натуральный логарифм интенсивности свечения. График представляет собой прямую линию, тангенсугла наклона которой к оси абсцисссоответствует константе инактивациилюцифераэы, Константа инактивациилюциферазы связана с.концентрациейпротеазы в образце прямой пропорциональной зависимостью.Для учета неспецифическойинактивации люцифераэы измерения,аналогичные описанным, проводят30 в отсутствии протеазы,За предельную чувствительностьметода принимают концентрацию протеазы, дающую, константу инактивация люциферазы, превышающую на35 50 константу неспецифической инактивации. Измеряют предельную чувствительность способа при разныхтемпературах (фиг. 1 . Максимальнаячувствительность наблюдается в40 интервале от 17 до 21 С,Минимальное время совместногоинкубирования люцифераэы с протеаэой при данной температуре определяется следующей формулой:45 1 ь -73ОКт,- Кгде Эо - активность люцифераэыв начале инкубирования;3 - активность люциферазычерез время Ф посленачала инкубирования;константа инактивациитрлюциферазы при даннойтемпературе в присутствии протеазы,К - константа инактивациилюцифераэы при даннойтемпературе в отсутст 60 вии протеазыПринимая во внимание, что ошибка в измерении активности люциферазы составляет +5, очевидно, что. Елоэ ог тР 1 тРУчитывая значение констант инакОтивации для температурного диапазона 17-21 РС, минимальное необходимое время совместного инкубирования составляет 9-13 ч.Концентрация препарата люциферазы 50 мкг/мл. Уменьшать концентрацию препарата люцифераэы не следует, так как это приводит к уменьшению светового сигнала ниже уровня:чувствительности прибора. Увеличивать концентрацию препарата выше100 мкг/мл также нецелесообразно,так как при этом не происходитувеличения чувствительности метода,расход препарата увеличивается. 25П.р и м е р 1. В качестве протеазы используют сухой препарат трипсина иэ поджелудочной железы быкас удельной активностью 40 ед. на1 .мг препарата ("Бегча" ФРГ) и частично очищенный препарат люцифераэы иэ РЬо 1 оЬасСег 1 цщ рЬоарЬогецщ.25 мкл раствора трипсина10 нг/мл ) сливают с 25 мкл препарата люцифераэы 50 мкг/мл ) и помещают в термостат при 20 оС, отмечая время начала инкубации, Черезкаждые 2 ч проводят измерения биолюминесцентной активности инкубируемого образца, для чего иэ последнегоотбирают аликвоты по 5 мкл. 40Для измерения биолюминесцентнойактивности используют следующуюреакционную смесь: 50 мкл 0,0025-ного раствора миристинового альдегидав дистиллированной воде; 5 мкл инкубационной смеси; 445 мкл 0,1 Мфосфатного буфра, рН 7,0.В полученной смеси свечение инициируют быстрым добавлением 300 мкл5 10-6 М ФМН-Н. Для учета неспецифической инактивации люцифераэыаналогичные измерения проводят вотсутствии препарата трипсина.Кинетика уменьшения биолюминес-.центной активности образца в присутствии и отсутствии трипсииа при 55,ведена на фиг. 2,Константы инактивации люцифера"зы в присутствии и отсутствии трипсина составляют 4,.410 4 мин "и0,5 10 фмин -" соответственно. При17 С эти константы составляют3,010 4 мин-"и 0,4 10-4 мин-, при21 РС - 4,45 1 Кфмин " и 1,519 4 мий.,Константы достоверно отличаются,поэтому можно сделать вывод, что 65 50 ли разница между этими величинамибудет не менее 20, т.е.Э)Зр 4 0,8.Следовательнс., формулу для опреде. -ления минимального времени совместного инкубирования можно переписать в следующем виде: 5 чувствительность метода позволяетобнаруживать трипсин при концентрации 5 нг/мп или с .учетом объемаобразца (0,05 мл) - 0,25 нг трипсина на иробу.П р и м е р 2. 25 мкл растворатрипсина (10 нг/мл) сливают с25 мкл препарата люциферазы.50 мкг/мп) и помещают в термостат,отрегулированный на температуру17 С, отмечая время начала инкубации.оЧерез каждые 2,5 ч проводят измерения биолюминесцентной активностиинкубируемого образца в течение13 ч, для чего из последнего отбирают аликвоты по 5 мкл.Для измерения биолюминесцентнойактивности используют следующую .реак-,.ционную смесь. 50 мкл 0,0025-ногораствора миристинового альдегида вдистиллированной воде, 5 мкл инкубационной смеси, 445 мкл 0,1 М фосфатного буфера, рН 7,0.В полученной реакционной смесисвечение инициируют быстрым добавлением 300 мкл 510М ФМН-Н ,Для учета неспецифической инактивации люциферазы аналогичные измерения проводят в отсутствии препарата трипсинаКонстанты инактивации в присутствии и отсутствии трипсина составляют3,0 10 4 мин "и 0,4 10 4 мин "соответственно.П р и м е р 3. Полученную инкубационную смесь помещают в термостатпри 20 С и отмечают время началаинкубации. Через каждые 2 ч проводятизмерения биолюминесцентной активности инкубируемого образца в течение 10 ч, Для учета неспецифическойинактивации люциферазы аналогичныеизмерения проводят в отсутствии препарата трипсина.Константы инактивации. в присутствии и отсутствии трипсина составляют 4,410-4 мин "и 0,5 10 4 минсоответственно. Чувствительность.метода 0,25 нг трипсина на пробу.П .р и м е р 4. Полученную инкубационную смесь помещают в термостатпри 21 рС и отмечают время началаинкубации, Через каждые 1,5 ч проводят замер биолюминесцентной активности инкубируемого образца в течение 11 ч. Для учета неспецифической инактивации люциферазы аналогичные измерения проводят в отсутствии препарата трипсинаКонстанты инактивации в присутствии и отсутствии трипсина составляют4,45 104 мин " и 1,510 4 мин, Чув-.)ствительность метода 0,25 нг трипсина на пробу.Таким образом, предлагаемый спо.соб позволяет повысить чувствительность определения активности протеазна два порядка за счет изменения усло-.ъвий инкубации протеазы с люциферазой. ъ1067441 ас Составитель С. Каспаров Техред ЗКастелевйч К р В. БУ Петро едакт Заказ 11203/ ВНИИраж 828венного. комитета СССРетений и открытий 35, Раушская наб., д. Ти Государст елам изобр осква,. Ж одписио по д113035,Филиал ПЛП фПатентф, г. Ужгород, ул. Проектная