Способ получения иммобилизованной люциферазы светляков

1189 1134Изобретение относится к биотехно-,логии, а именно к способу полученияиммобилиэованной люциферазы светляков.Цель изобретения - повышениеудельной активности и стабильностипрепарата,Способ осуществляют следующим образом.В качестве носителей для иммобилизации используют гидрофильные носители, которые хорошо адсорбируют липиды (Фосфо- или нейтральные липиды); а именно мембраны на основепроизводных целлюлозы: ацетил-, нитро- или тринитроцеллюлозу; или кремнеземные носители, например силикагель, силохром. Иммобилизацию люциферазы осуществляют путем физическойадсорбции фермента из буферного раствора на носителе, предварительнообработанном липидом. В качестве ли.пидов могут быть использованы разнообразные липиды; Фосфолипиды или .нейтральные липиды, например лецитин, сфингомиелин, холестерин, стеариновая кислота, а также, сложные смеси природных липидов, например смесь,выделенную экстракцией из лампочексветляков, которая кроме вьппеназванных липидов включает монофосфатиди линозит,.лизофосфатидилхолин, фосфатидилглицерин, фосфатидилэтаноламин,фосфатидную кислоту, высшие жирныекислоты, их триглицериды и эфиры жирных кислот и стеринов,Носители, предварительно не обработанные липидом, плохо адсорбируютлюциферазу и при промывке ферментлегко отделяется от носителя. Послеобработки носителя раствором липиданоситель приобретает способностьпрочно адсорбировать большие количества люциферазы. Для такой обработки носителя навеску его погружаютв раствор липида так, чтобы носительбыл полностью покрыт жидкостью, Концентрация липида в используемом растворе составляет 1 - 157 Использование более разбавленных растворовлипидов не позволяет получать иммобилизованную люциферазу с высокойудельной активностью, Использованиеболее концентрированных растворов липида экономически неоправдано, таккак это не влияет на активность получаемого иммобилизованного фермента.Инкубирование носителя в растворелипида в течение 0,2-1 ч оказывается достаточным для завершения процессаадсорбции липида на носителе. При более коротком времени обработки процесс адсорбции не доходит до равновесия, особенно при использованииразбавленных растворов липида, а более длительная инкубация не приводит к дополнительному положительномуэффекту. После инкубации носителя врастворе липида отделяют носитель отраствора любым известным методом ивысушивают в токе воздуха или другого газа при комнатной температуре.Отработанный раствор липида используют для обработки новой партии носителя. Это привОдит к экономии липида.Затем липидизированный носительполностью погружают в раствор фермента, охлажденный до 4 С, и инкубируютпри осторожном перемешивании20 ч. Активность люциферазы в растворе составляет (0,2 - 20) 10 мВ/мл,При использовании растворов с меньшей 25 активностью люциферазы получают препарат с низкой удельной активностью,а использование растворов с активностью люциферазы выше чем 20х 10 мВ/мл не приводит к дальнейшеЗ 0 му увеличению активности препарата.Раствор фермента должен обладатьионной силой 0,3 - 0,8 моль. При использовании концентраций соли ниже0,3 моль наблюцается ухудшение ад-,сорбции, снижение стабильности люци-феразы, а увеличение концентрациивыше 0,8 моль приводит к кристаллизации соли при пониженной температуре, Предпочтительным является использование 0,1 М трис-ацетатного буфера, 40содержащего в качестве стабилизирующих добавок 15-252 глицерина и 0,81,2 мг/мл дитиотрейтола, Но положительный эффект достигается и при использовании 0,1 М фосфатного буфера 45 без стабилизирующих добавок. После инкубирования носителя в растворе фермента носитель отделяют отраствора и промывают небольшими пор циями буферного раствора того жесостава, ито используют для приготовления раствора фермента. Отработанный раствор фермента используютдля обработки новой партии носителя.Получают препараты иммобилизованной люциферазы с удельной активностью(25-70) 10 э мВ/мг носителя, что в 10раз вьппе, чем в прототипе, Для мембран, содержащих иммобилизованную лю 1341циферазу, активность в расчете на1 см составляет 100 - 300 тыс мВ. Бпроцессе иммобилизации не происходитхимической модификации фермента, ко 5торая является одной из причин уменьшения активности люциферазы при ковалентном связывании. Иммобилизацияпроисходит за счет физической адсорбции люциферазы на липидизированномносителе, и иммобилизованная люцифераза сохраняет около 100% активностиот исходной,Получаемые препараты без лиофилизации сохраняют высокую активность втечение 10-20 дней при хранении ихпри 4 С, в то время как препаратылюциферазы, иммобилизованной на сефарозе, в тех же условиях за 20 днейтеряет 50% активности.Люцифераза, иммобилизованная налипидизированных мембранах, имеетв 10-50 раз более высокую активностьи стабильность, чем люцифераза, иммобилизованная ковалентно на целлюлозных пленках, Поэтому люцифераза,иммобилизованная на липидизированныхмембранах, хорошо пригодна для аналитического определения микроколичествАТФ, прячем одну и ту же пленку используют многократно. Полученную опи.санным способом иммобилизованную люциферазу используют для определенияАТФ. Предел обнаружения АТФ составляет 10" М.Изобретение поясняется следующими примерами,П р и м е р 1Нитроцеллюлознуюмембрану площадью 1,5 см погружаютв 1%-ный раствор лецитина в спиртеи инкубируют смесь в течение 0,2 ч,затем мембрану извлекают из раствора,высушивают в токе воздуха в течение15 мин и погружают в раствор люциферазы с активностью 0,2 10 мВ/мл.РаВствор люциферазы готовят в 0,1 М 45трис-ацетатном буферном растворе,рН 7,8,содержащем 0,3 моль КС 1, 15%глицерина, 0,8 мг/мл дитиотреитола.Смесь инкубируют 20 ч при 4 С, Затеммембрану извлекают из раствора фермента и промывают тремя порциями по1 мл вышеуказанного охлажденногобуферного раствора, а затем 2 порциями 0,1 М трис-ацетатного буферногораствора, рН 7,8. Для измерения ак- ббтивности иммобилизованной люциферазы полученную мембрану. помещают вкювету для измерения люминесценции,куда предварительно добавляют 1, 1 мл 18940,1 М трис-ацетатного буферного раствора, 0,1 мл 0,1 М МАМБО, и 0,15 мл 0,01 мМ раствора ТАФ в том же буферном растворе, Кювету с мембраной и раствором субстратов помещают в измерительное отделение люминометра, измеряют фоновое свечение, затем добавляют 0,15 мл 1 мМ раствора люциферина в том же буферном растворе. Удельная активность полученной иммобилизованной люциферазы составляет 2010 мВ/мг носителя или 80 10 мВ/см мембраны при насыщающих концентрациях субстратов, Отработанные растворы липида и фермента используют многократно для обработки новых образцов мембран вплоть до полного расходования растворов липида и ферментаМембрану с иммобилиэованной на ней люциферазой хранят в 0,1 М трис-ацетатном буферном растворе, содержащем 0,3 моль КС 1 и 0,8 мг/мл дитиотреитола, рН 7,8 при 4 С в течение 10 дней, измеряя каждый день активность люциферазы. Через 10 дней хранения мембрана сохраняет 70% от исходной активности.П р и м е р 2. Нитроцеллюлозную мембрану площадью 1,5 см погружают в 10%-ный раствор лецитина в спирте, инкубируют смесь в течение 0,5 ч, затем мембрану извлекают из раствора, высушивают в токе воздуха в течение 15 мин и погружают в раствор люциферазы с активностью 10 10 мВ/мл. Раствор люциферазы готовят в 0,1 М трис-ацетатном буферном растворе, рН 7,8, содержащем О,б моль КС 1, 20% глицерина, 1 мг/мл дитиотреитола.ОСмесь инкубируют 20 ч при 4 С. Затем мембрану извлекают из раствора и промывают так, как описано в примере 1, используя буферный раствор указанного в примере 2 состава. Далее измеряют активность иммобилизованной люциферазы, как описано в примере 1. Получают препарат иммобилизованной люциферазы с активностью 70 10 мБ/мг или 300 10 мВ/см мембраны. Все остальные операции выполняюткак описано в примере 1, но для хранения используют буферный раствор, содержащий 0,6 моль КС 1 и 1 мг/мл дитиотреитола. После 10 дней хранения мембрана сохраняет 90% от исходной активности,П р и м е р 3. Способ осуществляют согласно примеру 1, но носитель обрабатывают 15%-ным раствором лецитина в спирте в течение 1 ч и исполь5 13411зуют раствор люциферазы с активностью20 10 мВ/мл в О, 1 М трис-ацетатномбуферном растворе, рН 7,8, содержащем0,8 моль,КС 1, 1,2 мг/мл дитиотреитола и 253 глицерина. Получают препа 5рат иммобилизованной люциферазы сактивностью 50 10 мВ/мг или 200 "х 10 з мВ/см . Полученную мембрану хранят в О, 1 М трис-ацетатном буферном.растворе, содержащем 0,8 моль КС 1 и1,2 мг/мл дитиотреитола, После 10дней хранения мембрана сохраняет 907исходной активности люциферазы.П р и м е р 4. 50 мг силикагеляинкубируют в 0,5 мл 107-ного раствора лецитина в спирте в течение 20 мин,носитель затем отделяют от растворана стеклянном фильтре и высушивают навоздухе в течение 15-20 мин. Затем20носитель помещают в 0,5 мл растворалюциферазы с активностью 10 10 мВ/млв О, 1 М трис-ацетатном буферном растворе, рН 7,8, который содержит0,6 моль КС 1, 207 глицерина, 1 мг/млдитиотреитола, Смесь инкубируют втечение 20 ч при 4 С. Затем растворфермента отделяют от носителя настеклянном Фильтре, и носитель промывают так, как описано в примере 2.30Затем приготовляют суспензию иммобилизованной люциферазы, которая содержит 2 мг носителя на 1 мл буферногораствора, состав которого указан впримере 1 при определении активностифермента. Активность иммобилизованнойлюциферазы определяют, как описанов примере 1, используя вместо мембраны с иммобилизованной люциферазой0,1 мм суспензии носителя, соцержа 40щего иммобилизованную люциферазу.Получают препарат иммобилизованной люциферазы с активностью 50 10 мВ/мгносителяОтработанные растворы фермента и липида используют повторнодля обработки новой партии носителя,45до полного расходования взятых объемов растворов,896Стеариноваякислота 30 10Сфингомиелин 25 10 зСмесь липидов 50 . 10 зП р и м е р 6, Выполняют, как описано в примере 2, однако используют мембраны на основе тринитроцеллюлозы и ацетилцеллюлозы. При этом получают препараты иммобилизованной люциферазы с активностью и стабиль.костью, которые указаны в таблице. Ацетилцеллюлоза Активность мембраны, мВ/мг, 10 з 70, 10 з Остаточная активность после10 дней хранения, 7 90 90 50 24,255,758 П р и м е р 5. Способ осуществляют согласно примеру 2, но для обработки носителя используют различные липиды или смесь липидов, выделенную из лампочек светляков, При этом получают препараты с удельной активностью, которая указана ниже:Липид Активность мембраны, мВ/мгХолестерин , 10 з Используемый но- Тринитроцелситель люлоза П р и м е р 7. Способ осуществляют согласно примеру 2, однако используют для иммобилизации люциферазу в 0,1 М фосфатном буферном растворе, рН 7,8, содержащем 0,6 моль КС 1,Получают препарат иммобилизованной люциФеразы с активностью 25 10 з мВ/мг носителя, или 100 10 мВ/см мембраны. После 10 дней хранения при 4 С мембрана сохраняет 80 Е активности,П р и м е р 8. Все операции выполняют как описано в примере 4, однако вместо силикагеля используют 50 мг силохрома. Получают препарат иммобилизованной люциферазы с актив-ностью 30 10 мВ/мг носителя.П р и м е р 9, Препарат иммобилизованной люциферазы, полученный как описано в примере 2, используют для определения ультрамалых концентраций АТФ. Измерения проводят, как описано в примере 1, но концентрацию АТФ в измерительной кювете изменяют от 10 "з до 10 " М, При этом получают следующие сигналы биолюминесценции:Концентрация АТФ в Сигнал биолюмиизмеряемом раство- несценции, мВре, м10101 0-7110 "ф7 1341Таким образом, при использовании полученных препаратов иммобилизованной люциферазы детектируют ультрамалые концентрации АТФ.П р и м е р 10. Способ осуществля 5 ют согласно примеру 2. После промывания мембраны ее используют для изме- . рения биолюминесценции при концентрации АТФ в измеряемом растворе 10 М. 10 Состав измеряемого раствора такой же, как указано в примере 1 для определения активности люциферазы. Показания для сигнала биолюминесценции следующие: 15Измерения, Ф12320567101316 46 Сигнал, мВ50 48 46 42 49 45 39 42 43 2, Способ по п. 1, о т л и ч а -ю щ и й с я тем, что в качестве носителя используют кремнеземные носители или мембраны на основе нитротринитро- или ацетилцеллюлозы.3. Способ по пп, 1 и 2, о т л ич а ю щ и й с я тем, что из липидов используют лецитин или сфинго миелин, или холестерин, или стеариновую кислоту, или смесь липидов, выделенную из лампочек светляков.4, Способ по пп. 1 - 3, о т л ич а ю щ и й с я тем, что использу ют 0,1 М трис-ацетатный буферныйраствор рН 7,8 содержащий 0,30,8 моль КС 1, 15-253 глицерина, 0,812 мг/мл дитиотрейтола. Составитель Т, МелентьеваТехред Л.Сердюкова Корректор С. Шекмар Редактор Н, Хиштулинец Тираж 499 ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Заказ 4400/30 Подписное Производственно-полиграфическое предприятие, г, Ужгород, ул. Проектная, 4 Таким образом, мембрана с иммобилизованной люциферазой может быть ис. польэована многократно,Таким образом, предлагаемый способ позволяет повысить активность препаратов иммобилизованной люциферазы по сравнению с известными способами в 10 раз, а стабильность - в 2 раза, сократить расход фермента за счет полного сохранения активности люциферазы после иммобилизации и за счет многократного использования мембраны с иммобнлизованной люциферазой для определения микроколичеств 1898АТФ. Благодаря высокой активности препаратов иммобилизованной люцифераэы, получаемой предлагаемым способом, предел обнаружения АТФ снижается до 10 М. Формула изобретения 1. Способ получения иммобилизованной люцифераэы светляков, предусматриваюший инкубирование люциферазы в смеси с нерастворимым носителем в буферном растворе, о т л и ч а ющ и й с я тем, что, с целью повышеФния уДельной активности и стабильности препарата, инкубирование проводят в буферном растворе с ионной силой 0,3 - 0,8 моль, при этом используют гидрофильные носители, предваритель- но обработанные в течение 0,2 - 1,0 ч раствором фосфолипида или нейтрального липида, или их смесью в концентрации 1 - 157, а активность люцифераэы в растворе составляет (0,2-10) .10 мВ/мп.