Способ определения эстеразной активности в биологическом материале

СОКИ СОЕЕТСНИХСОЗФЛФМИВЕРЕСПУБЛИН ЛО. А УДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙПИСАНИЕ ИЗОБРЕАВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ ТЕНИН( 5 4 ) ( 5 7 ) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИ НОСТИ ЭСТЕРАЗЫ В БИОЛОГИЧЕСКОМ МА . ТЕРИАЛЕ путем физико-химического анализа пробы, о т л. и ч а ю ц и .с я тем, что, с целью оактивности эстеразы в забиологическом материале,ред замораживанием вводяцеиндипропиона в конечнтрации 10 - 10 М и поинтенсивности флуоресценэуюзцегося флуоресцеина оактивность эстеразы. и увез ешв.(71) Институт проблем криобиолои криомедицины АН УССР(56) 1. Дуэу П. Криобиохийия, МффМир 1 ф, 1980, с. 3-5.2. Реппеша О. АсС.чЪу оГ епп рагСа 11 у Ггогеп ацеоцз зузЮаФег Ве 1 аФ, Гоодв, Ргос. Вуп 1 р.01 аздо. Ьопйоп е.а., 1975, р.413 (прототип). 5 В 0 01 Н 33 У 48 Г пределе ния мороженномв него пе т Флуоресой конценнарастанию ции обра- пределяют-10 3 О 0 90 0 12 Таблица 2. 65 -1 310674Изобретениеотносится к физичес-кой химии и криобиохимии и можетнайти применение при изучении процессов замооаживанип - оттаивания,1а также пои консервировании сыворотки и клеток крови, органов и тканейи в пищевой проьыдленности.Известен спектрофотометрическийспособ определения активности рядаферментов в переохлажденных растворах, заключающийся в том, что реакцию проводят в переохлажденной среде,1содержащей органические растворители(этиленгликоль, метанол, пропиленгликоль, ДМСО и другие ), точказамерзайия которой ниже О С 11.Однако этот способ не позволяет 1 Ьопределить активность ферментовнепосредственно в замороженном состоянии,Известен также способ определения активности инвертазы при замораживании биологического объекта сразличной скоростью и до различныхтемператур, при котором замороженный биологический материал оттаивают и затемколориметрически опре-. . 25деляют активность инвертаэы 2 ,Этот способ также не позволяетопределять активность фермента непосредственно в замороженном биологическом материале.Целью изобретения является определение активности зстеразы в замороженном биологическом материале.Поставленная цель достигаетсятем, что согласно способу определения активности эстераэы в биологичемком материале путем физико-химического анализа пробы, в него перед,замораживанием вводят флуоресцеиндипойионат в конечной концентрации10 -10 М и по нарастанию интенсивности флуоресценции образующегосяфлуоресцеина олределяют активностьэстеразы.Способ осуществляют следующимобразом. 45В биологический материал (сус-пензия клеток, гомогенат клеток,суспензия лиэосом ) вводят нефлуоресцирующее соединение - Флуоресцеиндипрорионат - в конечной концентрации10 - 10 М, пробы сразу замораживают и определяют интенсивностьфлуоресценции образующегося флуоресцеииа при длине волны возбужденияЪе =486+1 нм и максимуме длины волны флуоресценции Ъф = 517+1 нм. Ин 55тенсивность флуоресценции находитсяв прямой зависимости от колиЧествафлуоресцеина, являющегося продуктом эстеразной реакцииП р.и м е,р 1. К 3,0 мл.дистилли- ЬОрованной воды добавляют 20 мкл сус"Пензии лнзосом 40 мг белка/мл 1), вы"деленных из изолированных клетокпечени крыс. В разведенную суспензиюлиэосом добавляют флуоресцеинди 42 ., Зпропионат в конечной концентрации 10 М и сразу же замораживают в парах жидкого азота до "10 С. После этого измеряют интенсивность флуорееценции флуоресцеина при длине волны возбуждения Яэ = 486 нм и максимуме длины волны флуоресценции 3 ф = 517 нм. Величина интенсивности флуоресценции служит в качестве контроля эстераэной реакции. Через 30 мин хранения при -100 С определяют интенсивность флуоресценции при длине волны возбуждения ) = .486 нм и максимуме длины волны флуоресценции 3 ф = 517 нм. Эту операцию повторяют через 30 мин в течение последующих 1,5 ч хранения при -100 С. В случае осуществления эстеразной реакции при комнатной температуре (+20. С) по такой же схеме ойа полностью завершается через 10 мин инкубации. Максимальный уровень флуоресценции одинаков в обоих случаях,Полученные данные приведены в табл. 1.Т а б л и ц а 1 П р и м е р 2, Проводят аналогично примеру 1, но при конечной концентруии флуоресцеиндипропионата 10 М,Полученные данные приведены в табл2.1067442 Предлагаемы способ позволяетпо возрастанию интенсивности фпуореС.ценции флуоресцеина, образующегосяв результате жстераэной реакции,судить о ходе и скорости эстераэной 5 реакции в замороженном биологическомматериале от 0 С до темнератур эвтектики. Продолжение табл. 2 46-го 50 Составитель Н. хрусталеваТехред С. Мигунова Корректор В. Вутяга Редактор М. Петрова Филиал ППП "Патент", г. ужгород, ул. Йроектная,. 4 Эакаэ 11203/4 Э Тираж 828 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5