Способ хроматографического определения жирнокислотного состава липидов природных объектов

(51) 0 01 М 31 08 С)ПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ ТОРСНО 42 .П.Нечаев Трудового логическийьышленности едование с. 242ам исслеконтролю ложнровой п т ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ(71) Иосковский орденаКрасного Знамени техноинститут пищевой про(56),1. Биохимическое исслмембран. М., "Мир", 1979,2. Руководство по методдования, технохимическомуи учету пройзводства в мапромышленности. Т. 1, кн.1967, с. 196.( 54) ( 57) СПОСОБ ХРОИАТОГРАФИЧЕСКОГООПРЕДЕЛЕНИЯ ЖИРНОКИСЛОТНОГО СОСТАВАЛИПИДОВ ПРИРОДНЫХ ОБЪЕКТОВ, включающий обработку исследуемого образцарастворителями с различной полярностью, отделение липидсодержащегоэкстракта от шрота с последующей отгонкой растворителя, обработку липидов метанолом и ацетилхлоридом,о т л и ч а ю щ и й с я тем, что,с целью сокращения времени анализа,исследуемый образец делят на три части) обработке растворителем параллельно подвергают две из них, используя в качестве растворителя при обработке первой части диэтиловый эфир с получением метиловых. эфиров жирных кислот суммы связанных и прочнбсвязанных липидов, второй части - хлоро-. форм-метанольную смесь в соотношении 2:1 с получением метиловых эфиров жирных кислот прочносвязанныхлипидов, третью часть непосредственно обрабатывают ацетнлхлоридом и метанолом с получением метиловых эфиров жирных кислот суммарных липидов, шроты, полученные после обработки первых двух частей, также обрабатывают ацетилхлоридом и метанолом, метило-,вые эфиры жирных кислот, полученные после обработки каждой части и шротов ф/ хроматографируют отдельно, при этом файф содержание жирных кислот свободных С липидов определяют по разности содержания жирных кислот, полученных послед обработки третьей и первой частей, содержание жирных кислот связанных липидов определяют по разности содержания жирных кислот, полученных осле обработки первой и второй часей исследуемого образца.Недостатком этого способа являются большие затраты времени, реактивов, многостадийность, трудоемкость.Цель изобретения - сокращение времени анализа. 60 Изобретение относится к способамколичественного определения жирнокислотного состава различных групплипидов с применением методов экст.ракции и газовой хроматографии и может быть использовано в области исследований липидов природных объектов,Известен способ определения жирнокислотного состава липидов природных объектов, заключающийся в обработке исследуемого материала хлороФорм-метанольной смесью, отделенииэкстракта от шрота, отгонке хлороформа и метанола с последующим хроматографированием метиловых эФиров жирных кислот свободных й связанных липидов, полученных после обработкилипидов метанолом и ацетилхлоридом.Исходный образец гомогенизируют в10 объемах метанола или смеси хло- .роформ - метанол 1:1) при комнатной температуре или при Оо С,К,гомогенизату добавляют метанол илихлороформ, чтобы количество растворителя на один объем исходного материала было не менее 20 объемовхлороформ;метанол = 2:1. Экстракциюповторяют три раза. После этого кобъединенным, надосадочным жидкостямдобавляют на 1 объем 0,2 объемаподкисленного СНСООН 0,1 М раствора КС 2. При стоянии 10-12 ч) образуется двухфазная система. Верхнийслой отбрасываютнижний промывают,упаривают и выделенные липиды обрабатывают метанолом и ацетилхлоридом. 35с последующим хроматографирЬваниемметиловых эфиров жирных кислот свободных и связанных липидов 13 .Недостатком этого способа являетсямногостадийность, трудоемкость, низкая точность и отсутствие возможности определения жирнокислотногосостава различных групп липидов,что особенно необходимо при исследовании липидного комплекса микроорганизмов, в котором связанные45и прочносвязанные липиды составляютзначительную часть.Наиболее близким к предложенному по технической сущности и дости- .гаемому результату является способ определения жирнокислотногосостава липидов природных объектов, включающий обработку исследуемого образца растворителями с различной .Полярйостью, отделение липидсодержащего экстракта от шротас последующей отгонкой растворителя,обработку липидов метанолом и ацетилхлоридом 21 . Поставленная цель достигается тем, что согласно способу хроматографического определения жирнокислотного состава липидов природных объектов, включающему обработку исследуемого образца растворителями с различной полярностью, отделение липидсодержащего экстракта от шрота с последующей отгонкой растворителя обработку липидов метанолом и аце) тилхлоридом, исследуемый образец делят на три части, обработке растворителем параллельно подвергают две из низ, используя в качестве растворителя при обработке первой части - диэтиловый эфир с получением метиловых эфиров жирных кислот суммы связанных и прочносвязанных липидов, второй части - хлороформметанольную смесь в соотношении 2;1 с получением метиловых эфиров жирных кислот прочносвязанных липидов, третью часть непосредственно обрабатывают ацетилхлоридом и метанолом с получением метиловых эфиров жирных кислот суммарных липчдов, шроты, полученные после обработки первых двух частей, также обрабатывают ацетилхлоридом и метанолом, метиловые эфиры жирных кислот, полученные после обработки каждой части и шротов, хроматографируют отдельно, при этом содержание жирных кислот свободных липидов определяют по разности содержания жир. ных кислот, полученных после обработки третьей и первой частей, содержание жирных кислот связанных липидов определяют по разности содержания жирных кислот, полученных после обработки первой и второй частей исследуемого образца.На чертеже показана схема определения жирнокислотного состава различных групп липидов по предлагаемому способу.Способ осуществляют следующим образом.Исследуемый образец делят на 3 части. Для определения жирнокислотного состава суммы связанных и прочносвязанных липидов одну часть образца исходного материала обрабатывают диэтиловым эфиром в соотношении 1: 10 на механической качалке в течение 3 ч с трехкратной заменой растворителя. Параллельно другую часть 200 мг) образца обрабатывают хлороформ-метанольной смесью (21). Для экстракции берут десятикратное количество растворителя, экстракцию проводят в три стадии. Продолжительность каждой .стадии 1 ч. Шроты, полученные после обработки 1-й и 2-й Части образца, высушивают до постоянного веса.9 третью часть образца и шроты вводят внутренний стандарт (2,0-ныйраствор арахиновой кислоты в хлороформе) и обрабатывают полученные образцы 5 мг ацетилхлорида и 2,5 мл метанола. Жидкую Фазу упаривают на песчаной бане при 80+30 С, после чего в каждую пробу вводят 0,1 мл гексана, 1 мкл гексановой вытяжки анализируют на хроматографе. Условия анализа. длина колонки 2 м, диаметр 3 мм, сорбент - хроматон Н-АИ-ОМСК (фракция 0,124-0,160 мм) с 20 диэтиленгликольсукцината. Температура термостата колонок 170 С, температура испарителя 2200 С, расход газа-носителя 40 см/мин, детектор - плазменно-ионизационный (ПИД). Расход водорода 400 см/мин.По хроматограмме жирнокислотного состава общих (суммарных) липидов определяют площадь полученных пиков и находят содержание отдельных жирных кислот в 1 г исследуемого образца по Формуле(2) В мг,5 вн Овгде 5 - площадь пика искомойкислоты, мм5 вн,- площадь пика внутреннегостандарта, ммнавеска внутреннего станин.сдарта, мгнавеска шрота после обраВботки исходного образцадиэтиловым эфиром, мг.По хроматограмме метиловых эфиров жирных кислот прочносвязанных липидов, содержащихся в последнем шроте, рассчитывают содержание жирных кислот прочносвязанных липидов по формуле" - щ иЮис чЬ где ц - навеска шрота после сня"ития суммы связанных и свободных липидов, мг;.де б; - площадь пика искомой кислоты, ммО - количество внутреннего станввн.сдарта, мгБВ, - площадь пика внутреннегостандарта, ммд - навеска исходного образца,цОмг.По хроматограмме метиловых эфиров жирных кислот суммы связанных и проч. носвязанных липидов, полученных после анализа шрота первой части образца, определяют содержание жирных кис кислот (В) в связанных и прочносвязанных липидах по Формулебд - вес шрота, полученного после обработки 1 г исходного образца.Содержание жирных кислот в свободных липидах определяется по раз- ности С = А; - О;, мг., (4) Содержание жирных кислот в связанных липидах определяется по Фор- муле 30 Е, = В; - Омг (5) П р и м е р. Объект исследова 15 ния - воздушно-сухие хлебопекарные дрожжи, содержащие в основном ли пиды в виде связанных и прочносвязанных групп.Исходный образец делят на тричасти. Для определения жирнокислотного состава суммарных липидов ктретьей части (100 мг добавляют2,0-ного раствора в хлороформе арахиновой кислоты в качестве внутреннего стандарта и обрабатывают 5 мгацетилхлорида и 2,5 мл метанола. Жидкую фазу упаривают на песчаной банепри 80+ЗОС, после чего в колбочкудобавляют 0,1 мл гексана. 1 мкл гексановой вытяжки вводят в хроматограф.Условия анализа: длина колонки 2 м,диаметр З,мм, сорбент-хроматонМЛИ-ОМС 5 (фракция 0,124-0,160 мм),с 20 диэтиленгликольсукцината. Температура термостата колонок 170 С, З 5 температура испарителя 2200 С, расходгаза-носителя 40 смЗ/мин. Детекторпламенно-ионизационный (ПИД 1. Расходводорода 40 смЗ/мин, воздуха400 смВ/мин.40 По хроматограмме жирнокислотногосостава суммарных липидов хлебопекарных дрожжей, определив площадь полученных пиков, находят содержаниеотдельных жирных кислот в 1 г хлебо пекарных дрожжей по ФоРмУле 11.Для определения жирнокислотногосостава суммы связанных и прочносвязанных липидов первую часть (200 мг)исходного материала обрабатываютдиэтиловым эфиром в соотношении1:10 на механической качалке в течение 3 ч с трехкратной заменой растворителя. Полученный шрот высушивают до постоянного веса и липиды,оставшиеся в шроте, обрабатывают5 мг ацетилхлорида и 2,5 мл метанола с последующим хроматографированием в указанных условиях. По хроматограмме метиловых эфиров жирныхкислот суммы связанных и прочносвя занных липидов определяют содержание жирных кислот в связанных и проч.носвязанных липидах по Формуле 2).Содержание жирных кислот в свободных липидах определяют по разносу ти (см. формулу 4 ).1054777 Содержание жирных кислот, мг на 1 г образца,в литрах Кислота свободньы прочносвя.эанных связанных суммарных 3,06 2,25 0,99 6,30 4,11 С 164 10,26 1,64 14,963,07 17,44 0,34 2,34 0,38 С 8 4,25 4,25 23,72 С щ 8.2,15 0,81 0,51 3,47 Для определения жирнокислотного состава связанных:и прочносвязанных липидов первую часть исходного образца (200 мг) обрабатывают хлороформ-метанольной смесью (2;1), исходный образец - растворитель в соотношении 1:10, в течение 3 ч с трехкратной заменой растворителя. Шрот высушивают до постоянного веса, обрабатывают 5 мг ацетилхлорида и 2,5 мл метанола и хроматографируют в указанных условиях. Использование предлагаемого спо.соба по сравнению с прототипом позволяет уменьшить продолжительность определения жирнокислотного состава .различных групп липидов в 4-8 раз (с 47 ч до 14-5 ч) и повысить точПо хроматограмме метиловых эфиров жирных кислот прочносвязанных липидов, содержащихся в последнем шроте; рассчитывают содержание жирных кислот. прочносвяэанных липидов по формуле (3). Содержание жирных кислот в связанных липидах определяется по разности (см, формулу 5).1 О Результаты анализов и расчетовсведены в таблицу ность анализа в 1, 5-3 раза за счетсокращения количества операций (с30 до 20), что способствует уменьше.нию потерь исследуемого образца, и35 параллельно с этим сократить расходреактивов в 2"7 раз,ВНИИПИ Заказ 9096/51Тираж 873 Подписное филиал ППП "Патент",г,ужгород,ул,Проектная,4