Способ получения токсинов клостридий

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 0% И) 12 и 1 ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕН АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРГЮ ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ(56) 1. Ту. 42.КВС В 330-69 на химическую сорбнрованную брюшно тифозную вакцину с концентрированньи очищенньи сорбированным секста /тетра"/анатоксином (прототип).(54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТОКСИНОВКЛОСТРИДИИ путем внесения посевногоматериала в питательную среду, последующей инкубации и выделения целевого продукта, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью увеличения целевого прсдукта выхсда посевнойматериал предварительно обрабатывают специфической к нетоксигенньи особям иммунной сывороткой.Изобретение относится к областимедицины и может быть использованов производстве противогангренозныхсывоооток и анатоксинов,. а также вклинической микробиологии при диагностике клостридиозов.Клостридии - токсигенные микроорганизмы, обусловливающие тяжелыезаболевания с высокой летальностью.Клостридии подвержены высокой степени изменчивости, зависящей как10от состава искусственнсй питательной с Оедына которой их куль тиниоуют. ,так и от других внешних фактооов. В этой связи внутри популяции образуются особи, которые нс )5продуциру:от ни токсинов, ни энзимов,присущих каждому виду,В популяции, образовавшейсядаже из единичной клетки, специфические мутанты могут возникать с частатой 1 на 107 родительских, клетокпосле небольшого по продолжительности периода размножения и могут достичь такой плотности, что потомствомутантов будет составлять значительную часть популяции. Этому можетспособствовать старение культуры,различная скорость роста родительских клеток и мутантов, состав питательной среды и другие селективныеФакторы. Популяции производственныхштаммов - продуцентов токсинов основных видов клсстридий в отношениитоксигенности и энэиматической активнос 1 и гетеосгенны,Известен способ получения токсинов путем посева возбудителей анаэробных инфекций - продуцентов ток -синов на мясные или казеиновые питательные среды, заключающийся в том,что в связи с изменчивостью штаммовпродуцентов подбирают культуры повысшему уоовню продукции токсина:иэ нескольких посевов отбирают такой,который дает наибольшие титры токсина (при титрации на лабораторньг животных), и используют в качестве маточной культуры )1), При этом неучитывают наличие в чей нетоксигенных особей.5 ОНедостатком известного способа является низкий выход целевого продукта - токсина,Цель изобретения - увеличить выход целевого продукта.Цель достигается тем, что в способе получения токсинов клостридий путем внесения посевного материала в питательную среду, последующей инкубации и выделения целевого продукта посевной материал предварительно 6 О обрабатывают специфической к нетоксигенным особям иммунной сывороткой.Авторы установили, что нетоксигенные особи внутри популяции существенно влияют на токсинообраэующую 65 Функцию токсигенных особей и резкоснижают содержание токсинов и энзимов в конечйом продукте, Это явление снижает возможность быстро ичетко проводить лабораторную диагностику клостридий, а также мешает впроизводственной практике получатьвысокоактивные анатоксины и антитоксические сыворотки. Низкий выходтоксинов, получаемых известным способом, является следствием того, чтоизвестный способ че устраняет угнетающего влияния нетоксигенныхособей на продукцию токсина токсигенными особями в гетерогенной популяции маточной культуры.П р и м е р 1. Во Флаконы или бутыли с мартеновским или казеиновымбульоном добавляют 0,5 глюкозы,среду прогсевают при 80 20 мин и Остуживают до 40-45 , Маточную культуору производственного штамма С 1регтг 1 пуеп э 28 (типа А) центрифугируют при 5000-6000 оборотах 15-20 мин.В остуженный до указанной температуры бульон вносят осадок культурыпроизводственного штамма, предварительно обработанный в течение 60-90мин при 37 раьным объемом агглютиниорующей сыворотки к нетоксигеннымособям производственного штамма 28или к эталонному нетоксигенномуштамму С 1, регйг 1 паег, э 27 (титрсыворотки 1: 32),Выход альфа-токсина (лецитиназы)в 4-8 раэ превышает выход по известному способу, в результате чего резко снижаются затраты на производствопротивогангренозных сывороток и ана-токсинов,П р и м е р 2. Испытаны маточнаякультура производственного штамма 28,вццеленннй из нее нетоксигенныйклон 28 х, а также нетоксигенныйштамм 27., Результаты приведены втабл, 1,Данные представленные в табл. 1,показывают,. что специфическая кнетоксигенному клону 28 х сывороткаснимает ингибирующее влияние особейклона 28 х на процесс токсинообразования особями штамма 28. Специфическая к штамму 27 сыворотка оказывает менее выраженное действие, однако ее добавление в гетерогеннуюпопуляцию также приводит к значительному повышению титра лецитиназы посравнению с контролем,П р и м е р 3. Для доказательства наличия угнетающего действия нетоксигенных особей С 1. регйс 1 пс 3 ег э на синтез токсина токсигенными особями гетерогенной популяции провели опыт с искусственными смесями клеток производственного токсинообра эуницего штамма 28 с клетками выделенного986100 10 Специфическаяк штамму 28 3 64 ф 5,2 256 ф Специфиче к клону 2 56+4 9 178+73 Специфическак штамму 27 51 5+ 128+ 3 Контроль (беэ обработки сыв роткой) 128 Таблиц Влияние нетоксигенных особей на синтез ксина токсигенньми особями смешанной попул яции2 Культу Количествопосевов Лецитинаэнаактивность 8 ф 0,48+ 28 х (1:0,1) 3+ 22,6 2 5 каз 10642/7 Тираж 523 Подписное ВНИИПИ атент",г,уигород,ул.Проектная,4 филиал П из него нетоксигенного клона 28 х,Результаты приведены в табл, 2,Представленные в табл. 2 данныесвидетельствуют о значительном угнетакщем действии нетоксигенных особейна процесс токсинообраэования токси-, 5генными особями.Таким образом, новый способ получения токсинов клостридий эначительЛецитиназная активность 28+28 х (1: 1) 28+28 х (1: О, 5 28+28 х(1:0,4 28+28 х (1: О, 3 28+28 х (1: О, 2но повышает выход токсинов, что поэ"воляет повысить эффективность идентификации штаммов клостридий, потерявших свою токсигениость. Новый способ позволяет избежать расходы, свяэанные с использованием животных п 9 иподборе маточной культурыпу-тем определения титра токсина. 1 Таблица 1изученных популяций